上下同时向两张膜转移法、电转移法和真空转移法。 最初所选用的固相支持物是硝酸纤维素膜,核酸通过疏水相互作用与硝酸纤 维素膜结合,牢固程度较差,在碱性条件下的结合能力进一步下降,且这种膜质 地较脆,操作时需格外小心。目前核酸杂交实验多采用尼龙膜,尼龙膜坚固耐用, 可进行多次杂交;而且核酸可在低离子强度下结合到尼龙膜上,可用电转移法将 DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶上转移到尼龙膜上,极大提髙了转移效率,在紫外 线照射下,核酸可与尼龙膜发生共价结合而被固定。另外,带电荷的尼龙膜结合 核酸的能力更强,且带正电荷的尼龙膜在碱性转移缓冲液中可与核酸共价结合, 转移后不需进行固定。 以毛细管转移法介绍印记转移的操作过程:①将修整后的凝胶浸泡于脱嘌呤 缓冲液中直至溴酚蓝变为黄色;②弃掉脱嘌呤缓冲液,用去离子水冲洗凝胶数次; ③将胶浸入变性缓冲液,室温轻摇40min:④弃掉变性缓冲液,用去离子水冲洗 凝胶一次;⑤将胶放置在毛细管转移装置上,DNA片段转移需16小时;⑥将胶 从转移装置上取下,在杂交膜上对应于点样孔位置作适当记号;⑦用2×SSC缓 冲液淋洗杂交膜数秒:⑧将杂交膜放入烘箱,80℃烘烤5omi;⑨将杂交膜不含 DNA的一面朝向312nm紫外灯照射3min以固定DNA。 (三)探针 任选探针制备中所提供的方法制备放射性标记的或非放射性标记的探针。 (四)杂交 杂交的目的是以带有标记物的探针去对目的核酸进行定性、定位检测,而探 针与目的核酸的准确复性是影响杂交实验的关键所在,所以,杂交环境及用于进 行杂交的探针的特异性和纯度对于确保杂交实验的成功就显得尤为重要。 杂交步骤包括:①于杂交管中用6×SSC洗膜,之后加入10m预杂交液,65℃ 摇动4h;②探针于沸水中变性5min,变性后的探针与10ml(65℃)混合;③弃 去预杂交液,加入含有探针的杂交液,42℃摇动过夜;④杂交结束后,将膜取出, 放入含有数百毫升洗膜液A的器皿中,轻轻震荡洗膜5min,此时勿使膜干燥 ⑤如果探针是被放射性物质标记的,应将洗膜后的废液倒λ处理放射性污染的废 液缸中;⑥向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液B,轻轻震荡洗膜15mi,洗 后弃去洗膜液;⑦向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液C,65℃轻轻震荡2h上下同时向两张膜转移法、电转移法和真空转移法。 最初所选用的固相支持物是硝酸纤维素膜，核酸通过疏水相互作用与硝酸纤 维素膜结合，牢固程度较差，在碱性条件下的结合能力进一步下降，且这种膜质 地较脆，操作时需格外小心。目前核酸杂交实验多采用尼龙膜，尼龙膜坚固耐用， 可进行多次杂交；而且核酸可在低离子强度下结合到尼龙膜上，可用电转移法将 DNA 片段从聚丙烯酰胺凝胶上转移到尼龙膜上，极大提高了转移效率，在紫外 线照射下，核酸可与尼龙膜发生共价结合而被固定。另外，带电荷的尼龙膜结合 核酸的能力更强，且带正电荷的尼龙膜在碱性转移缓冲液中可与核酸共价结合， 转移后不需进行固定。。 以毛细管转移法介绍印记转移的操作过程：①将修整后的凝胶浸泡于脱嘌呤 缓冲液中直至溴酚蓝变为黄色；②弃掉脱嘌呤缓冲液，用去离子水冲洗凝胶数次； ③将胶浸入变性缓冲液，室温轻摇 40min；④弃掉变性缓冲液，用去离子水冲洗 凝胶一次；⑤将胶放置在毛细管转移装置上，DNA 片段转移需 16 小时；⑥将胶 从转移装置上取下，在杂交膜上对应于点样孔位置作适当记号；⑦用 2×SSC 缓 冲液淋洗杂交膜数秒；⑧将杂交膜放入烘箱，80℃烘烤 50min；⑨将杂交膜不含 DNA 的一面朝向 312nm 紫外灯照射 3min 以固定 DNA。 （三）探针 任选探针制备中所提供的方法制备放射性标记的或非放射性标记的探针。 （四）杂交 杂交的目的是以带有标记物的探针去对目的核酸进行定性、定位检测，而探 针与目的核酸的准确复性是影响杂交实验的关键所在，所以，杂交环境及用于进 行杂交的探针的特异性和纯度对于确保杂交实验的成功就显得尤为重要。 杂交步骤包括：①于杂交管中用 6×SSC 洗膜，之后加入 10ml 预杂交液，65℃ 摇动 4h；②探针于沸水中变性 5min，变性后的探针与 10ml（65℃）混合；③弃 去预杂交液，加入含有探针的杂交液，42℃摇动过夜；④杂交结束后，将膜取出， 放入含有数百毫升洗膜液 A 的器皿中，轻轻震荡洗膜 5min，此时勿使膜干燥！ ⑤如果探针是被放射性物质标记的，应将洗膜后的废液倒入处理放射性污染的废 液缸中；⑥向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液 B，轻轻震荡洗膜 15min，洗 后弃去洗膜液；⑦向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液 C，65℃轻轻震荡 2h；