(1)在冰水浴中混合下列反应成分于微量离心管中,组成DNA限制性内 切酶酶切反应体系混合液: 酶切缓冲液 lmg/ml的牛血清白蛋白 待切割的DNA 加灭菌蒸馏水至终体积为50μul,混匀,于4℃放置Ih,以确保DNA均匀分 (2)取出冷冻的限制性内切酶,待溶化后,用灭菌微量吸管迅速吸取5单 位酶加入反应管中,在冰水浴中温和搅拌2min,再升至酶切反应所需的温度(大 多数酶的反应温度为37℃,但有些酶的反应温度偏高或偏低,所以应以酶的产 品说明书提供的温度为准),保温Ih(如果是基因组DNA,保温8~12h)。 (3)如果使用的限制性内切酶不只一种,消化20min后,加入第二份限制 酶(5单位/gDNA),重复步骤② (4)取2山反应后的酶切样品,加上样液后电泳检查酶切是否完全。 3.琼脂糖凝胶电泳选择不同浓度(0.2%~3%)的琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳结束后于紫外灯下检测。 4.琼脂糖凝胶电泳的印记转移探针与目的DNA片段的杂交所依附的支 持物可以是液相的也可以是固相的,常用的是固相支持物。在将电泳分离后的 DNA片段转印到固相支持物上之前,要对琼脂糖凝胶上的DNA片段进行适当处 理,首先,将电泳后的DNA片段在紫外灯下与 marker进行对比,看目的DNA 片段是否较长(>15kb),大片段的DNA转移较慢且效率较低,可以用弱酸进 行脱嘌呤处理,以水解DNA成较小片段来增加转卬效率,通常脱嘌呤处理应在 弱酸环境下作用到溴酚蓝变成黄色或二甲苯青变成黄绿色,水解后的DNA片段 长度以为原来长度的三分之一左右为宜,过短的DNA片段在印记转移过程中容 易丢失和扩散,扩散将使检测观察到的DNA条带模糊。其次,要对双链DNA 进行变性处理。这些处理工作完成后将琼脂糖凝胶上的DNA片段以适当的方法 转移到固相支持物上以备杂交 将电泳分离后的DNA片段转移到固相支持物是印记杂交的关键步骤,目前, 常用的转移方法有五种:液流向上的毛细管转移法、液流向下的毛细管转移法、（1）在冰水浴中混合下列反应成分于微量离心管中，组成 DNA 限制性内 切酶酶切反应体系混合液： 酶切缓冲液 5μl 1 mg/ml 的牛血清白蛋白 5μl 待切割的 DNA 1μg 加灭菌蒸馏水至终体积为 50μl，混匀，于 4℃放置 1h，以确保 DNA 均匀分 散。 （2）取出冷冻的限制性内切酶，待溶化后，用灭菌微量吸管迅速吸取 5 单 位酶加入反应管中，在冰水浴中温和搅拌 2min，再升至酶切反应所需的温度（大 多数酶的反应温度为 37℃，但有些酶的反应温度偏高或偏低，所以应以酶的产 品说明书提供的温度为准），保温 1h（如果是基因组 DNA，保温 8～12h）。 （3）如果使用的限制性内切酶不只一种，消化 20min 后，加入第二份限制 酶（5 单位/μg DNA），重复步骤②。 （4）取 2μl 反应后的酶切样品，加上样液后电泳检查酶切是否完全。 3．琼脂糖凝胶电泳 选择不同浓度（0.2%～3%）的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳结束后于紫外灯下检测。 4．琼脂糖凝胶电泳的印记转移 探针与目的 DNA 片段的杂交所依附的支 持物可以是液相的也可以是固相的，常用的是固相支持物。在将电泳分离后的 DNA 片段转印到固相支持物上之前，要对琼脂糖凝胶上的 DNA 片段进行适当处 理，首先，将电泳后的 DNA 片段在紫外灯下与 marker 进行对比，看目的 DNA 片段是否较长（＞15kb），大片段的 DNA 转移较慢且效率较低，可以用弱酸进 行脱嘌呤处理，以水解 DNA 成较小片段来增加转印效率，通常脱嘌呤处理应在 弱酸环境下作用到溴酚蓝变成黄色或二甲苯青变成黄绿色，水解后的 DNA 片段 长度以为原来长度的三分之一左右为宜，过短的 DNA 片段在印记转移过程中容 易丢失和扩散，扩散将使检测观察到的 DNA 条带模糊。其次，要对双链 DNA 进行变性处理。这些处理工作完成后将琼脂糖凝胶上的 DNA 片段以适当的方法 转移到固相支持物上以备杂交。 将电泳分离后的 DNA 片段转移到固相支持物是印记杂交的关键步骤，目前， 常用的转移方法有五种：液流向上的毛细管转移法、液流向下的毛细管转移法