(5)碱基组成有一定影响,但影响不大 (6)温度4~30℃都可,常为室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质,因此 用于分析RNA时,必须加入蛋白质变性剂,如甲醛等。图410为分离后DNA与各种杂 质的分布。 电泳完毕后,将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染」 入 DNA/Hind Ill 色(0.5μg/ml)。啡啶溴红为一扁平分子,很易插入DNA 的碱基对之间。DNA与啡啶溴红结合后,经紫外光照射, 23130 可发射出红一橙色可见荧光。01μgDNA即可用此法检 6557 出,所以此法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断DNA 4371 样品的浓度。若在同一胶上加一已知其浓度的DNA作参 考,则所测得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的 232 负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下 2028 来,作进一步分析与长期保留之用 应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。图4-11ADA/Hind片段 实用的方法是在同一胶上加一已知相对分子质量的样品(如 琼脂糖凝胶电泳图 图411中的ADNA/HndI的片段)。电泳完毕后,经啡啶 溴红染色、照相,从照片上比较待测样品中的DNA片段与 标准作品中的哪一条带最接近,即可推算出未知样品中各片段的大小。最常用的方法是将 胶上某一区带在紫外光照射下切割下来,将切下的胶条放在透析袋中,装上电泳液,在水 平电泳槽中进行电泳,让胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上,电泳3~4h 后,将电极倒转,再通电30~60s,粘在壁上的DNA 重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液(丢弃 胶条),用苯酚抽提1~2次,水相用乙醇沉淀。这样 回收的DNA纯度很高,可供进一步进行限制酶分析 序列分析或作末端标记。回收率在50%以上 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加入交 联剂后就成了聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼 脂糖胶的要小,所以可用于分析小于100的DNA 片段。聚丙烯酰胺中一般不含有 RNase,所以可用于 RNA的分析 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品,经啡啶溴红染色, 在紫外光照射下,发出的荧光很弱,所以浓度很低的 核酸样品用此法检测不出来 波长 、核酸的紫外吸收 图4-12DNA的紫外吸收光谱 1天然DNA:2变性DNA:3.核苷酸总吸收－90－ （5）碱基组成 有一定影响，但影响不大； （6）温度 4～30℃都可，常为室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析 DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，因此 用于分析 RNA 时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等。图 4-10 为分离后 DNA 与各种杂 质的分布。 电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染 色（0.5μg／ml）。啡啶溴红为一扁平分子，很易插入 DNA 的碱基对之间。DNA 与啡啶溴红结合后，经紫外光照射， 可发射出红—橙色可见荧光。0.1μgDNA 即可用此法检 出，所以此法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断 DNA 样品的浓度。若在同一胶上加一已知其浓度的 DNA 作参 考，则所测得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的 负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下 来，作进一步分析与长期保留之用。 应用凝胶电泳可以正确地测定 DNA 片段的分子大小。 实用的方法是在同一胶上加一已知相对分子质量的样品（如 图 4-11 中的λDNA／HindIII 的片段）。电泳完毕后，经啡啶 溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的 DNA 片段与 标准作品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。最常用的方法是将 胶上某一区带在紫外光照射下切割下来，将切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水 平电泳槽中进行电泳，让胶上的 DNA 释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳 3～4h 后，将电极倒转，再通电 30～60s，粘在壁上的DNA 重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃 胶条），用苯酚抽提 1～2 次，水相用乙醇沉淀。这样 回收的 DNA 纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、 序列分析或作末端标记。回收率在 50％以上。 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加入交 联剂后就成了聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼 脂糖胶的要小，所以可用于分析小于 1000bp 的 DNA 片段。聚丙烯酰胺中一般不含有 RNase，所以可用于 RNA 的分析。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色， 在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的 核酸样品用此法检测不出来。 三、核酸的紫外吸收 图 4-11 λDNA／HindIII 片段 琼脂糖凝胶电泳图 图 4-12 DNA 的紫外吸收光谱 1.天然 DNA；2.变性 DNA；3.核苷酸总吸收