嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~29nm的紫外 波段有一强烈的吸收峰,最大吸收值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所 以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定少量的DNA或RNA。检验待测样品是否纯品可用紫外 分光光度计读出260nm与280nm的OD值,从OD2/OD2s0的值即可判断样品的比纯 纯DNA的OD260/ODo应为1.8,纯RNA的应为20。样品中如含有杂蛋白及苯酚 OD26/OD∞o的值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定时测定。对于纯的样品, 只要读出260mm的OD值即可算出含量。通常按OD值相当于50μg/ml双螺旋DNA, 或40μg/ml单螺旋DNA(或RNA),或20μg/ml寡核苷酸计算。这个方法既快速又准 确,而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后,经啡啶溴 红染色而粗略地估计其含量。图4-12为DNA的紫外吸收光谱 四、核酸的变性、复性和分子杂交 高温、酸、碱以及某些变性剂(如尿素)能破坏核酸中的氢键,使之断裂,核酸中的 双螺旋区变成单链,并不涉及共价键的断裂,这一过程称为核酸的变性 当将DNA的稀盐溶液加热到80~00℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链分开,形 成无规线团(如图4-13),一系列理化性质也随之发生改变:260nm区紫外吸收值升高 粘度降低,浮力密度升高,同时改变二级结构,有时可以失去部分或全部生物活性。DNA 的变性的特点是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内 增色效应一DNA从天然状态转变为变性状态其溶液的Ax60值增加,称之为增色效应 减色效应一当变性的呈单链状态的DNA,经复性又重新形成双螺旋结构时,其溶液 的A26值则减小,最多可减小至变性前的A260值,这种现象则称为减色效应。引致减色效 应的原因是碱基状态的改变,DNA复性后其碱基又重新埋藏于双螺旋内部,碱基对又呈堆 积状态,这样就使碱基吸收紫外光的能力减弱。 ~9 双螺旋DNA 部分解链DNA DNA分开成无规则线团 链内碱基配对 图4-13DNA的变性过程 通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度( melti mperature),用Tm表示。DNA的Tm值一般在70~85℃之间(如图414)－91－ 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240～290 nm的紫外 波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在 260 nm 附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所 以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定少量的 DNA 或 RNA。检验待测样品是否纯品可用紫外 分光光度计读出 260 nm与 280 nm的 OD值，从 OD260／OD280的值即可判断样品的比纯 度。纯 DNA的 OD260／OD280应为 1.8，纯 RNA的应为 2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚， OD260／OD280 的值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定时测定。对于纯的样品， 只要读出260nm 的 OD 值即可算出含量。通常按 1OD值相当于50μg／ml双螺旋 DNA， 或 40μg／ml 单螺旋 DNA（或 RNA），或 20μg／ml 寡核苷酸计算。这个方法既快速又准 确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴 红染色而粗略地估计其含量。图4-12 为 DNA 的紫外吸收光谱。 四、核酸的变性、复性和分子杂交 高温、酸、碱以及某些变性剂（如尿素）能破坏核酸中的氢键，使之断裂，核酸中的 双螺旋区变成单链，并不涉及共价键的断裂，这一过程称为核酸的变性。 当将 DNA 的稀盐溶液加热到80～l00℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形 成无规线团（如图 4-13）, 一系列理化性质也随之发生改变：260 nm区紫外吸收值升高， 粘度降低，浮力密度升高，同时改变二级结构，有时可以失去部分或全部生物活性。DNA 的变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 增色效应—DNA 从天然状态转变为变性状态其溶液的A260 值增加，称之为增色效应。 减色效应—当变性的呈单链状态的 DNA，经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液 的 A260 值则减小，最多可减小至变性前的 A260值，这种现象则称为减色效应。引致减色效 应的原因是碱基状态的改变，DNA 复性后其碱基又重新埋藏于双螺旋内部，碱基对又呈堆 积状态，这样就使碱基吸收紫外光的能力减弱。 图 4-13 DNA 的变性过程 通常把 DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该 DNA的熔点或熔解温度（melting temperature），用 Tm 表示。DNA 的 Tm值一般在 70～85℃之间（如图 4-14）