(6)加入血清孵育10min (⑦)甩去血清,滴加第一抗体,孵育30-60min。(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照) (8)PBS洗5min×3次 (9)滴加第二抗体,孵育20min。 (10)PBS洗5min×3次。 (11)加入SP复合物孵育20-30min (12)PBS洗5min×3次。。 (13)DAB-H2O2显色,在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应。 (14)自来水冲洗。 (15) Harris苏木素染核5-10min。 (16)水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。 SP法是目前国内使用最广泛的一种方法,90年代初提出了用链卵蛋白素替代ABC法中的卵白素生物素复合物。 该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白,有四个和生物素亲和力极高的结合点。敏感性强,效果好,背景清 晰而无非特异性染色,阳性物突出,明显易辨,节省时间,抗体可以高度稀释,增加标记病例,降低成本 (三)结果判断及分析 由于影响染色结果的因素很多,如不同厂家生产的抗体特异性和敏感性不同、检测试剂盒特异性和敏感性不 同、技术熟练程度以及固定包埋组织处理的技术差异等,其结果判断标准化问题尚难统一,但一般应掌握以下原 阳性判定:在阳性对照为阳性结果,阴性对照出现阴性结果的前提下,阳性表达在细胞和组织特定的抗原部 位。即阳性细胞定位准确,是胞膜、胞浆还是胞核阳性,而且间质清晰,无背景着色。阳性细胞一般应在5%以上 可定位阳性,阳性结果有强弱、多少之分。 阴性判定:阳性对照为阳性结果,阴性对照出现阴性结果时,可初步确认。但阴性结果不能视为抗原不表 应该结合具体情况分析 由于抗体尚存在特异性与敏感性不足;或者内源性干扰、试剂不纯,交叉反应等:或者组织处理不当,组织细 胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、搓加、失效、变质等),操作失误等多种因素影响。实验结果会出现错误,或为 假阳性或为假阴性。假阳性是指实验切片呈阳性,阴性对照组织或阴性试剂对照也城阳性的结果。假阴性是指实验 切片呈阴性,阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果。因此,不能单纯依靠免疫酶细胞化学结果做出诊 断,必须以常规组织学改变为基础,结合组织化学染色、电镜、分子生物学检测等结果才能做出正确诊断。当免疫 酶细胞化学结果与常规切片诊断有矛盾时,一般以常规切片诊断为准。(6)加入血清孵育10min。   (7)甩去血清，滴加第一抗体，孵育30-60min。（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；   (8)PBS洗5min×3次。   (9)滴加第二抗体，孵育20min。   (10)PBS洗5min×3次。   (11)加入SP复合物孵育20-30min。   (12)PBS洗5min×3次。。   (13)DAB-H2O2显色，在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应。 (14)自来水冲洗。   (15)Harris苏木素染核5-10min。   (16)水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。   SP法是目前国内使用最广泛的一种方法，90年代初提出了用链卵蛋白素替代ABC法中的卵白素生物素复合物。 该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物素亲和力极高的结合点。敏感性强，效果好，背景清 晰而无非特异性染色，阳性物突出，明显易辨，节省时间，抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。   （三）结果判断及分析   由于影响染色结果的因素很多，如不同厂家生产的抗体特异性和敏感性不同、检测试剂 盒特异性和敏感性不 同、技术熟练程度以及固定包埋组织处理的技术差异等，其结果判断 标准化问题尚难统一，但一般应掌握以下原 则：    阳性判定：在阳性对照为阳性结果，阴性对照出现阴性结果的前提下，阳性表达在细胞和组织特定的抗原部 位。即阳性细胞定位准确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性，而且间质清晰，无背景着色。阳性细胞一般应在5%以上， 可定位阳性，阳性结果有强弱、多少之分。    阴性判定：阳性对照为阳性结果，阴性对照出现阴性结果时，可初步确认。但阴性结果不能视为抗原不表达， 应该结合具体情况分析。   由于抗体尚存在特异性与敏感性不足；或者内源性干扰、试剂不纯，交叉反应等；或者组织处理不当，组织细 胞抗原丢失或试剂错误（如漏加、搓加、失效、变质等），操作失误等多种因素影响。实验结果会出现错误，或为 假阳性或为假阴性。假阳性是指实验切片呈阳性，阴性对照组织或阴性试剂对照也城阳性的结果。假阴性是指实验 切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果。因此，不能单纯依靠免疫酶细胞化学结果做出诊 断，必须以常规组织学改变为基础，结合组织化学染色、电镜、分子生物学检测等结果才能做出正确诊断。当免疫 酶细胞化学结果与常规切片诊断有矛盾时，一般以常规切片诊断为准