步骤: (1)~(5)同直接法。 6)滴加适度稀释的第一抗体,湿盒内温育30-60min。或4℃过夜。(用PBS液代替一抗作阴性对照) (7)PBS洗5min×3次 (8)滴加第二抗体,湿盒内温育30-60min (9)PBS洗5min×3次。 (10)滴加PAP复合物,湿盒内温育30-60min。 (11)以后步骤同直接法(7)~(11)步 20世纪90年代初期,PAP法是较敏感和特异的的染色方法被应用,敏感度高出间接法20倍左右,但存在问题: 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物:第一抗体的稀释度很关键,处理不当造成假阴性;PA复合物分子较 大,移动缓慢,对组织的渗透力不强,可产生背景染色,影响阳性结果 4ABC法和SABC法 ABC法是卵白素-生物素-酶复合物( Avidin- Biotin- Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生 物素-酶复合物( Streptavidin- Biotin-Peroxidase Complex)法的简称 步骤 (1)~(5)同直接法。 (6)滴加适度稀释的第一抗体,湿盒内温育30-60mins(用PBS液代替一抗作阴性对照)。 (7)PBS洗5min×3次。 (8)滴加生物素化的第二抗体,湿盒内温育30min (9)PBS洗5min×3次 (10)滴加ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制),湿盒内温育30-60min (11)以后步骤同直接法(7)~(11)步。 ABC法的优点是:敏感性强,特异性较强,背景染色淡,方法简单,节约时间,并且由于生物素与抗生物素具 有和多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。SABC法敏感性比ABC高4-8倍,特异性强,背景更清晰 5.SP法( streptavidin- perosidase,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法) 步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)0.3%H2O2甲醇处理切片10-20mine (3)PBS洗5min×3次 (4)抗原修复。 (5)PBS洗5min×3次。步骤：    (1)∼(5)同直接法。   (6)滴加适度稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。或4℃过夜。（用PBS液代替一抗作阴性对照）；   (7)PBS洗5min×3次。   (8)滴加第二抗体，湿盒内温育30-60min。   (9)PBS洗5min×3次。   (10)滴加PAP复合物，湿盒内温育30-60min。   (11)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。   20世纪90年代初期，PAP法是较敏感和特异的的染色方法被应用，敏感度高出间接法20倍左右，但存在问题： 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物；第一抗体的稀释度很关键，处理不当造成假阴性；PAP复合物分子较 大，移动缓慢，对组织的渗透力不强，可产生背景染色，影响阳性结果。   4.ABC法和SABC法   ABC法是卵白素-生物素-酶复合物（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex）法的简称。SABC法是链霉卵白素-生 物素-酶复合物（Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex）法的简称。   步骤：   (1)∼(5)同直接法。   (6)滴加适度稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。（用PBS液代替一抗作阴性对照）。   (7)PBS洗5min×3次。   (8)滴加生物素化的第二抗体，湿盒内温育30min。   (9)PBS洗5min×3次   (10)滴加ABC复合物或SABC复合物（皆于使用前新鲜配制），湿盒内温育30-60min。   (11)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。   ABC法的优点是：敏感性强，特异性较强，背景染色淡，方法简单，节约时间，并且由于生物素与抗生物素具 有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。SABC法敏感性比ABC高4-8倍，特异性强，背景更清晰。 5.SP法（streptavidin-perosidase，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）   步骤：    (1)切片脱蜡至水。   (2)0.3%H2O2甲醇处理切片10-20min。 (3)PBS洗5min×3次。   (4)抗原修复。   (5)PBS洗5min×3次