免疫酶组织化学的标记物是酶,它利用某些酶能催化一些底物产生不溶性的有色物质,从而即可在光镜下显示 抗原物质的存在,常用标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AKP)。染色方法: 1.直接法用酶标记的特异性抗体(Ab1-HRP)直接与标本中的相应抗原反应结合,沉积在抗原抗体反应的部 位,形成抗原-抗体-酶复合物,最后再用酶底物显色剂显色,即可对抗原进行定性、定位以至定量研究 步骤: (1)组织切片常规脱蜡入水 (2)胰蛋白酶或胃蛋白酶消化,37℃,0.5-2min。PBS冲洗3次。(石蜡切片建议采用高温加热抗原修复)。 (3)0.3%H202甲醇液(封闭内源性酶)10-15min。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始 (4)PBS洗,5min×3次 (5)正常血清或牛血清白蛋白孵育15min,室温 (6)甩掉覆盖在切片上的上述(5)血清,加酶标记抗体,37℃30-60min,置湿盒内。(用PBS缓冲液代替一抗 作阴性对照) (7)PBS洗5min×3次。 ⑧8)DAB显色。在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应,以结果清晰,背景无非特异性染色为度 (9)自来水充分冲洗。 (10)需要时用苏木素染液复染胞核 (11)封片。若用DAB等显色,可经乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水,用吸水纸 去周围组织多余的水份,直接将水溶性封片剂(如明胶甘油)封片。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、 阳性对照及抑制试验。 直接法简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低。其缺点是,每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物,且 敏感性较间接法低 2.间接法用酶标记在第二抗体(Ab2-HRP)上,先将第一抗体(特异性抗体,Ab1)与相应的组织抗原结合,形 成抗原-抗体复合物,再用第二抗体(酶标记的抗体)与复合物中的特异性抗体结合,形成抗原-抗体酶标抗体复 合物,最后用酶底物显色剂显色 步骤: (1)~(5)同直接法。 (6)甩掉正常血清,滴加适当稀释度的特异性抗体(Ab1),37℃,30-60min,或4℃过夜,置湿盒内 (7)PBS洗5min×3次 ⑧8)滴加适当稀释的酶标抗体(例如Ab2-HRP)于标本上,室温或37℃,30min。(用PBS缓冲液代替一抗作阴性 对照 (9)以后步骤同直接法(7)~(11)步 间接法是自身抗体检査的常用方法,用于免疫酶细胞化学染色敏感性不够,很少采用。 3.PAP法用第二抗体作“桥梁”,既与第一抗体结合,再与PAP复合物(过氧化物酶-抗过氧化物酶, peroxidase- antiperoxidase,PAP)联结,最后用酶底物显色剂显色。免疫酶组织化学的标记物是酶，它利用某些酶能催化一些底物产生不溶性的有色物质，从而即可在光镜下显示 抗原物质的存在，常用标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）。染色方法：   1.直接法用酶标记的特异性抗体（Ab1-HRP）直接与标本中的相应抗原反应结合，沉积在抗原抗体反应的部 位，形成抗原-抗体-酶复合物，最后再用酶底物显色剂显色，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。   步骤：   (1)组织切片常规脱蜡入水。   (2)胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，37℃，0.5-2min。PBS冲洗3次。（石蜡切片建议采用高温加热抗原修复）。   (3)0.3％H2O2甲醇液（封闭内源性酶）10-15min。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始。 (4)PBS洗，5min×3次。   (5)正常血清或牛血清白蛋白孵育15min,室温。   (6)甩掉覆盖在切片上的上述（5）血清，加酶标记抗体，37℃30-60min，置湿盒内。（用PBS缓冲液代替一抗 作阴性对照）；   (7)PBS洗5min×3次。   (8)DAB显色。在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。   (9)自来水充分冲洗。   (10)需要时用苏木素染液复染胞核。   (11)封片。若用DAB等显色，可经乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水，用吸水纸 去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（如明胶甘油）封片。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、 阳性对照及抑制试验。   直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。其缺点是，每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且 敏感性较间接法低。   2.间接法用酶标记在第二抗体（Ab2-HRP）上，先将第一抗体（特异性抗体，Ab1）与相应的组织抗原结合，形 成抗原-抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复 合物，最后用酶底物显色剂显色。    步骤：   (1)∼(5)同直接法。   (6)甩掉正常血清，滴加适当稀释度的特异性抗体（Ab1），37℃，30-60min，或4℃过夜，置湿盒内。   (7)PBS洗5min×3次。   (8)滴加适当稀释的酶标抗体（例如Ab2-HRP）于标本上，室温或37℃，30min。（用PBS缓冲液代替一抗作阴性 对照）；   (9)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。   间接法是自身抗体检查的常用方法，用于免疫酶细胞化学染色敏感性不够，很少采用。   3.PAP法用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物（过氧化物酶-抗过氧化物酶， peroxidase-antiperoxidase,PAP）联结，最后用酶底物显色剂显色