免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是利用抗体和抗原能特异性结合的原理,通过标记酶的化学反应催化酶底物显色达到标记 细胞内某种抗原性物质的定性、定位及定量的检测技术。常用的方法有PAP法,ABC法,SP法,SABC法等,其中以SP 法,SABC法较为优越。免疫酶组织化学技术在诊断病理方面的主要应用包括:①肿瘤组织来源鉴别诊断,如上皮 性、间叶性、肌源性、血管源性、淋巴细胞源性等:②肿瘤的良恶性辅助诊断,如Ki6η、PCN等抗体对肿瘤增生程 度的判断:③微小转移灶识别,如对淋巴结内极少转移性细胞的査找等;④确定肿瘤分期,判断肿瘤是原位还是浸 润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关:⑤激素受体的检测,指导临床治疗,如乳腺癌雌激素、孕激素受 体的检测等:⑥激素类细胞的定性和定位,辅助诊断内分泌细胞肿瘤的类型和功能状态:⑦肿瘤的预后判断,如癌 基因的免疫酶细胞化学检测,瘤细胞抗药性的检测等:⑧免疫性疾病的辅助诊断,如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等 组织内免疫球蛋白、补体、免疫复合物的检测:⑨病毒感染性疾病的病因诊断等。 (一)组织处理与抗原修复 组织标本处理 免疫酶细胞化学技术对标本要求较高,不仅要保持组织细胞形态的完整,更需要保持细胞或组织成分的抗原 性,使之不受损或弥散,这是获得理想的免疫酶细胞化学染色结果的前提。特别是那些抗原含量少的组织标本,若 处理不当,易造成抗原的丢失或破坏,导致人为的阴性结果,而影响观察和判断。 1.取材对活检标本和手术切除标本,取材时间在2h以内,一般超过2h,组织有不同程度的自溶,其抗原有不 同程度的变性消失或严重弥散,石蜡切片最佳厚度3-5μ皿,冷冻切片可相对厚些。为保存组织的抗原性,新鲜标本 离体后,应立即取材置液氮或-40℃至-70℃的低温冰箱保存,冷冻切片亦可置-40℃至-70℃的低温冰箱或普通冰箱 (-20℃)保存,但最好在一周内作免疫酶细胞化学染色 2.固定采用10%中性缓冲甲醛作为常规固定剂。一般的固定时间24h。冷冻切片的固定,一般用4℃冷丙酮在室 温下固定10min。也可使用微波进行组织固定,其方法:将组织块放入塑料包埋盒内,投入1000nl的塑料缸内(聚丙 烯塑料缸最妤)并加入生理盐水500m,调整微波功率(300-500W),调整辐射时间4-5mi,温度5-55℃,自动停 机后,自然冷却即可进入脱水流程。 3.玻片处理玻片的处理是做好免疫酶细胞化学染色的重要步骤之一,如果处理不当,在染色过程中出现掉 片。现常用防脱片剂APES或多聚赖氨酸处理玻片,详见本章第三节。 4.组织处理程序石蜡制片过程基本同普通切片,但烤片不宜温度过高,时间过长。若某些抗原极易破坏丢失, 需做冷冻切片 抗原修复 常规石蜡切片标本,一般均用甲醛固定。经甲醛固定的部分组织细胞,免疫酶细胞化学标记敏感性明显降低, 因此在染色时,需要先进行抗原修复。常用抗原修复方法如下 1.胰蛋白酶消化方法滴加胰蛋白酶消化液,然后将切片放置在湿盒内,37oC,10-30min即可。胰蛋白酶消化 液配制方法,详见本章第三节 2.胃蛋白酶消化方法0.4%胃蛋白酶,用0. IN HCL配制,详见本章第三节。消化时间370C,3min 3.单纯加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中,置电炉上加热至沸腾,并持续10min. 4.高压加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内,置电炉上加热至喷气,并持续2-3mi。 5.微波方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的微波炉专用容器中,置微波炉上加热使温度保持在95-100℃,并 持续10min (二)兔疫标记方法免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是利用抗体和抗原能特异性结合的原理，通过标记酶的化学反应催化酶底物显色达到标记 细胞内某种抗原性物质的定性、定位及定量的检测技术。常用的方法有PAP法，ABC法，SP法，SABC法等，其中以SP 法，SABC法较为优越。免疫酶组织化学技术在诊断病理方面的主要应用包括：①肿瘤组织来源鉴别诊断，如上皮 性、间叶性、肌源性、血管源性、淋巴细胞源性等；②肿瘤的良恶性辅助诊断，如Ki67、PCNA等抗体对肿瘤增生程 度的判断；③微小转移灶识别，如对淋巴结内极少转移性细胞的查找等；④确定肿瘤分期，判断肿瘤是原位还是浸 润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关；⑤激素受体的检测，指导临床治疗，如乳腺癌雌激素、孕激素受 体的检测等；⑥激素类细胞的定性和定位，辅助诊断内分泌细胞肿瘤的类型和功能状态；⑦肿瘤的预后判断，如癌 基因的免疫酶细胞化学检测，瘤细胞抗药性的检测等；⑧免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等 组织内免疫球蛋白、补体、免疫复合物的检测；⑨病毒感染性疾病的病因诊断等。    （一）组织处理与抗原修复 组织标本处理    免疫酶细胞化学技术对标本要求较高，不仅要保持组织细胞形态的完整，更需要保持细胞或组织成分的抗原 性，使之不受损或弥散，这是获得理想的免疫酶细胞化学染色结果的前提。特别是那些抗原含量少的组织标本，若 处理不当，易造成抗原的丢失或破坏，导致人为的阴性结果，而影响观察和判断。    1.取材 对活检标本和手术切除标本，取材时间在2h以内，一般超过2h，组织有不同程度的自溶，其抗原有不 同程度的变性消失或严重弥散，石蜡切片最佳厚度3-5μm，冷冻切片可相对厚些。为保存组织的抗原性，新鲜标本 离体后，应立即取材置液氮或-40℃至-70℃的低温冰箱保存，冷冻切片亦可置-40℃至-70℃的低温冰箱或普通冰箱 （-20℃）保存，但最好在一周内作免疫酶细胞化学染色。   2.固定 采用10%中性缓冲甲醛作为常规固定剂。一般的固定时间24h。冷冻切片的固定，一般用4℃冷丙酮在室 温下固定10min。也可使用微波进行组织固定，其方法:将组织块放入塑料包埋盒内，投入1000ml的塑料缸内（聚丙 烯塑料缸最好）并加入生理盐水500ml，调整微波功率（300-500W），调整辐射时间4-5min，温度50-55℃，自动停 机后，自然冷却即可进入脱水流程。    3.玻片处理 玻片的处理是做好免疫酶细胞化学染色的重要步骤之一，如果处理不当，在染色过程中出现掉 片。现常用防脱片剂APES或多聚赖氨酸处理玻片，详见本章第三节。   4.组织处理程序石蜡制片过程基本同普通切片，但烤片不宜温度过高，时间过长。若某些抗原极易破坏丢失， 需做冷冻切片。   抗原修复    常规石蜡切片标本，一般均用甲醛固定。经甲醛固定的部分组织细胞，免疫酶细胞化学标记敏感性明显降低， 因此在染色时，需要先进行抗原修复。常用抗原修复方法如下：    1.胰蛋白酶消化方法 滴加胰蛋白酶消化液，然后将切片放置在湿盒内，37oC，10-30min即可。胰蛋白酶消化 液配制方法，详见本章第三节。   2.胃蛋白酶消化方法 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCL配制，详见本章第三节。消化时间37oC，30min。   3.单纯加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置电炉上加热至沸腾，并持续10min.   4.高压加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内，置电炉上加热至喷气，并 持续2-3min。    5.微波方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的微波炉专用容器中，置微波炉上加热使温度保持在95-100℃，并 持续10min。   （二）免疫标记方法