免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是利用抗体和抗原能特异性结合的原理,通过标记酶的化学反应催化酶底物显色达到标记 细胞内某种抗原性物质的定性、定位及定量的检测技术。常用的方法有PAP法,ABC法,SP法,SABC法等,其中以SP 法,SABC法较为优越。免疫酶组织化学技术在诊断病理方面的主要应用包括:①肿瘤组织来源鉴别诊断,如上皮 性、间叶性、肌源性、血管源性、淋巴细胞源性等:②肿瘤的良恶性辅助诊断,如Ki6η、PCN等抗体对肿瘤增生程 度的判断:③微小转移灶识别,如对淋巴结内极少转移性细胞的査找等;④确定肿瘤分期,判断肿瘤是原位还是浸 润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关:⑤激素受体的检测,指导临床治疗,如乳腺癌雌激素、孕激素受 体的检测等:⑥激素类细胞的定性和定位,辅助诊断内分泌细胞肿瘤的类型和功能状态:⑦肿瘤的预后判断,如癌 基因的免疫酶细胞化学检测,瘤细胞抗药性的检测等:⑧免疫性疾病的辅助诊断,如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等 组织内免疫球蛋白、补体、免疫复合物的检测:⑨病毒感染性疾病的病因诊断等。 (一)组织处理与抗原修复 组织标本处理 免疫酶细胞化学技术对标本要求较高,不仅要保持组织细胞形态的完整,更需要保持细胞或组织成分的抗原 性,使之不受损或弥散,这是获得理想的免疫酶细胞化学染色结果的前提。特别是那些抗原含量少的组织标本,若 处理不当,易造成抗原的丢失或破坏,导致人为的阴性结果,而影响观察和判断。 1.取材对活检标本和手术切除标本,取材时间在2h以内,一般超过2h,组织有不同程度的自溶,其抗原有不 同程度的变性消失或严重弥散,石蜡切片最佳厚度3-5μ皿,冷冻切片可相对厚些。为保存组织的抗原性,新鲜标本 离体后,应立即取材置液氮或-40℃至-70℃的低温冰箱保存,冷冻切片亦可置-40℃至-70℃的低温冰箱或普通冰箱 (-20℃)保存,但最好在一周内作免疫酶细胞化学染色 2.固定采用10%中性缓冲甲醛作为常规固定剂。一般的固定时间24h。冷冻切片的固定,一般用4℃冷丙酮在室 温下固定10min。也可使用微波进行组织固定,其方法:将组织块放入塑料包埋盒内,投入1000nl的塑料缸内(聚丙 烯塑料缸最妤)并加入生理盐水500m,调整微波功率(300-500W),调整辐射时间4-5mi,温度5-55℃,自动停 机后,自然冷却即可进入脱水流程。 3.玻片处理玻片的处理是做好免疫酶细胞化学染色的重要步骤之一,如果处理不当,在染色过程中出现掉 片。现常用防脱片剂APES或多聚赖氨酸处理玻片,详见本章第三节。 4.组织处理程序石蜡制片过程基本同普通切片,但烤片不宜温度过高,时间过长。若某些抗原极易破坏丢失, 需做冷冻切片 抗原修复 常规石蜡切片标本,一般均用甲醛固定。经甲醛固定的部分组织细胞,免疫酶细胞化学标记敏感性明显降低, 因此在染色时,需要先进行抗原修复。常用抗原修复方法如下 1.胰蛋白酶消化方法滴加胰蛋白酶消化液,然后将切片放置在湿盒内,37oC,10-30min即可。胰蛋白酶消化 液配制方法,详见本章第三节 2.胃蛋白酶消化方法0.4%胃蛋白酶,用0. IN HCL配制,详见本章第三节。消化时间370C,3min 3.单纯加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中,置电炉上加热至沸腾,并持续10min. 4.高压加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内,置电炉上加热至喷气,并持续2-3mi。 5.微波方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的微波炉专用容器中,置微波炉上加热使温度保持在95-100℃,并 持续10min (二)兔疫标记方法
免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是利用抗体和抗原能特异性结合的原理，通过标记酶的化学反应催化酶底物显色达到标记 细胞内某种抗原性物质的定性、定位及定量的检测技术。常用的方法有PAP法，ABC法，SP法，SABC法等，其中以SP 法，SABC法较为优越。免疫酶组织化学技术在诊断病理方面的主要应用包括：①肿瘤组织来源鉴别诊断，如上皮 性、间叶性、肌源性、血管源性、淋巴细胞源性等；②肿瘤的良恶性辅助诊断，如Ki67、PCNA等抗体对肿瘤增生程 度的判断；③微小转移灶识别，如对淋巴结内极少转移性细胞的查找等；④确定肿瘤分期，判断肿瘤是原位还是浸 润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关；⑤激素受体的检测，指导临床治疗，如乳腺癌雌激素、孕激素受 体的检测等；⑥激素类细胞的定性和定位，辅助诊断内分泌细胞肿瘤的类型和功能状态；⑦肿瘤的预后判断，如癌 基因的免疫酶细胞化学检测，瘤细胞抗药性的检测等；⑧免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等 组织内免疫球蛋白、补体、免疫复合物的检测；⑨病毒感染性疾病的病因诊断等。 （一）组织处理与抗原修复 组织标本处理 免疫酶细胞化学技术对标本要求较高，不仅要保持组织细胞形态的完整，更需要保持细胞或组织成分的抗原 性，使之不受损或弥散，这是获得理想的免疫酶细胞化学染色结果的前提。特别是那些抗原含量少的组织标本，若 处理不当，易造成抗原的丢失或破坏，导致人为的阴性结果，而影响观察和判断。 1.取材 对活检标本和手术切除标本，取材时间在2h以内，一般超过2h，组织有不同程度的自溶，其抗原有不 同程度的变性消失或严重弥散，石蜡切片最佳厚度3-5μm，冷冻切片可相对厚些。为保存组织的抗原性，新鲜标本 离体后，应立即取材置液氮或-40℃至-70℃的低温冰箱保存，冷冻切片亦可置-40℃至-70℃的低温冰箱或普通冰箱 （-20℃）保存，但最好在一周内作免疫酶细胞化学染色。 2.固定 采用10%中性缓冲甲醛作为常规固定剂。一般的固定时间24h。冷冻切片的固定，一般用4℃冷丙酮在室 温下固定10min。也可使用微波进行组织固定，其方法:将组织块放入塑料包埋盒内，投入1000ml的塑料缸内（聚丙 烯塑料缸最好）并加入生理盐水500ml，调整微波功率（300-500W），调整辐射时间4-5min，温度50-55℃，自动停 机后，自然冷却即可进入脱水流程。 3.玻片处理 玻片的处理是做好免疫酶细胞化学染色的重要步骤之一，如果处理不当，在染色过程中出现掉 片。现常用防脱片剂APES或多聚赖氨酸处理玻片，详见本章第三节。 4.组织处理程序石蜡制片过程基本同普通切片，但烤片不宜温度过高，时间过长。若某些抗原极易破坏丢失， 需做冷冻切片。 抗原修复 常规石蜡切片标本，一般均用甲醛固定。经甲醛固定的部分组织细胞，免疫酶细胞化学标记敏感性明显降低， 因此在染色时，需要先进行抗原修复。常用抗原修复方法如下： 1.胰蛋白酶消化方法 滴加胰蛋白酶消化液，然后将切片放置在湿盒内，37oC，10-30min即可。胰蛋白酶消化 液配制方法，详见本章第三节。 2.胃蛋白酶消化方法 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCL配制，详见本章第三节。消化时间37oC，30min。 3.单纯加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置电炉上加热至沸腾，并持续10min. 4.高压加热方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内，置电炉上加热至喷气，并 持续2-3min。 5.微波方法将切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的微波炉专用容器中，置微波炉上加热使温度保持在95-100℃，并 持续10min。 （二）免疫标记方法
免疫酶组织化学的标记物是酶,它利用某些酶能催化一些底物产生不溶性的有色物质,从而即可在光镜下显示 抗原物质的存在,常用标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AKP)。染色方法: 1.直接法用酶标记的特异性抗体(Ab1-HRP)直接与标本中的相应抗原反应结合,沉积在抗原抗体反应的部 位,形成抗原-抗体-酶复合物,最后再用酶底物显色剂显色,即可对抗原进行定性、定位以至定量研究 步骤: (1)组织切片常规脱蜡入水 (2)胰蛋白酶或胃蛋白酶消化,37℃,0.5-2min。PBS冲洗3次。(石蜡切片建议采用高温加热抗原修复)。 (3)0.3%H202甲醇液(封闭内源性酶)10-15min。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始 (4)PBS洗,5min×3次 (5)正常血清或牛血清白蛋白孵育15min,室温 (6)甩掉覆盖在切片上的上述(5)血清,加酶标记抗体,37℃30-60min,置湿盒内。(用PBS缓冲液代替一抗 作阴性对照) (7)PBS洗5min×3次。 ⑧8)DAB显色。在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应,以结果清晰,背景无非特异性染色为度 (9)自来水充分冲洗。 (10)需要时用苏木素染液复染胞核 (11)封片。若用DAB等显色,可经乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水,用吸水纸 去周围组织多余的水份,直接将水溶性封片剂(如明胶甘油)封片。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、 阳性对照及抑制试验。 直接法简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低。其缺点是,每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物,且 敏感性较间接法低 2.间接法用酶标记在第二抗体(Ab2-HRP)上,先将第一抗体(特异性抗体,Ab1)与相应的组织抗原结合,形 成抗原-抗体复合物,再用第二抗体(酶标记的抗体)与复合物中的特异性抗体结合,形成抗原-抗体酶标抗体复 合物,最后用酶底物显色剂显色 步骤: (1)~(5)同直接法。 (6)甩掉正常血清,滴加适当稀释度的特异性抗体(Ab1),37℃,30-60min,或4℃过夜,置湿盒内 (7)PBS洗5min×3次 ⑧8)滴加适当稀释的酶标抗体(例如Ab2-HRP)于标本上,室温或37℃,30min。(用PBS缓冲液代替一抗作阴性 对照 (9)以后步骤同直接法(7)~(11)步 间接法是自身抗体检査的常用方法,用于免疫酶细胞化学染色敏感性不够,很少采用。 3.PAP法用第二抗体作“桥梁”,既与第一抗体结合,再与PAP复合物(过氧化物酶-抗过氧化物酶, peroxidase- antiperoxidase,PAP)联结,最后用酶底物显色剂显色
免疫酶组织化学的标记物是酶，它利用某些酶能催化一些底物产生不溶性的有色物质，从而即可在光镜下显示 抗原物质的存在，常用标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）。染色方法： 1.直接法用酶标记的特异性抗体（Ab1-HRP）直接与标本中的相应抗原反应结合，沉积在抗原抗体反应的部 位，形成抗原-抗体-酶复合物，最后再用酶底物显色剂显色，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。 步骤： (1)组织切片常规脱蜡入水。 (2)胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，37℃，0.5-2min。PBS冲洗3次。（石蜡切片建议采用高温加热抗原修复）。 (3)0.3％H2O2甲醇液（封闭内源性酶）10-15min。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始。 (4)PBS洗，5min×3次。 (5)正常血清或牛血清白蛋白孵育15min,室温。 (6)甩掉覆盖在切片上的上述（5）血清，加酶标记抗体，37℃30-60min，置湿盒内。（用PBS缓冲液代替一抗 作阴性对照）； (7)PBS洗5min×3次。 (8)DAB显色。在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。 (9)自来水充分冲洗。 (10)需要时用苏木素染液复染胞核。 (11)封片。若用DAB等显色，可经乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水，用吸水纸 去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（如明胶甘油）封片。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、 阳性对照及抑制试验。 直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。其缺点是，每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且 敏感性较间接法低。 2.间接法用酶标记在第二抗体（Ab2-HRP）上，先将第一抗体（特异性抗体，Ab1）与相应的组织抗原结合，形 成抗原-抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复 合物，最后用酶底物显色剂显色。 步骤： (1)∼(5)同直接法。 (6)甩掉正常血清，滴加适当稀释度的特异性抗体（Ab1），37℃，30-60min，或4℃过夜，置湿盒内。 (7)PBS洗5min×3次。 (8)滴加适当稀释的酶标抗体（例如Ab2-HRP）于标本上，室温或37℃，30min。（用PBS缓冲液代替一抗作阴性 对照）； (9)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。 间接法是自身抗体检查的常用方法，用于免疫酶细胞化学染色敏感性不够，很少采用。 3.PAP法用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物（过氧化物酶-抗过氧化物酶， peroxidase-antiperoxidase,PAP）联结，最后用酶底物显色剂显色
步骤: (1)~(5)同直接法。 6)滴加适度稀释的第一抗体,湿盒内温育30-60min。或4℃过夜。(用PBS液代替一抗作阴性对照) (7)PBS洗5min×3次 (8)滴加第二抗体,湿盒内温育30-60min (9)PBS洗5min×3次。 (10)滴加PAP复合物,湿盒内温育30-60min。 (11)以后步骤同直接法(7)~(11)步 20世纪90年代初期,PAP法是较敏感和特异的的染色方法被应用,敏感度高出间接法20倍左右,但存在问题: 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物:第一抗体的稀释度很关键,处理不当造成假阴性;PA复合物分子较 大,移动缓慢,对组织的渗透力不强,可产生背景染色,影响阳性结果 4ABC法和SABC法 ABC法是卵白素-生物素-酶复合物( Avidin- Biotin- Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生 物素-酶复合物( Streptavidin- Biotin-Peroxidase Complex)法的简称 步骤 (1)~(5)同直接法。 (6)滴加适度稀释的第一抗体,湿盒内温育30-60mins(用PBS液代替一抗作阴性对照)。 (7)PBS洗5min×3次。 (8)滴加生物素化的第二抗体,湿盒内温育30min (9)PBS洗5min×3次 (10)滴加ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制),湿盒内温育30-60min (11)以后步骤同直接法(7)~(11)步。 ABC法的优点是:敏感性强,特异性较强,背景染色淡,方法简单,节约时间,并且由于生物素与抗生物素具 有和多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。SABC法敏感性比ABC高4-8倍,特异性强,背景更清晰 5.SP法( streptavidin- perosidase,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法) 步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)0.3%H2O2甲醇处理切片10-20mine (3)PBS洗5min×3次 (4)抗原修复。 (5)PBS洗5min×3次
步骤： (1)∼(5)同直接法。 (6)滴加适度稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。或4℃过夜。（用PBS液代替一抗作阴性对照）； (7)PBS洗5min×3次。 (8)滴加第二抗体，湿盒内温育30-60min。 (9)PBS洗5min×3次。 (10)滴加PAP复合物，湿盒内温育30-60min。 (11)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。 20世纪90年代初期，PAP法是较敏感和特异的的染色方法被应用，敏感度高出间接法20倍左右，但存在问题： 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物；第一抗体的稀释度很关键，处理不当造成假阴性；PAP复合物分子较 大，移动缓慢，对组织的渗透力不强，可产生背景染色，影响阳性结果。 4.ABC法和SABC法 ABC法是卵白素-生物素-酶复合物（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex）法的简称。SABC法是链霉卵白素-生 物素-酶复合物（Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex）法的简称。 步骤： (1)∼(5)同直接法。 (6)滴加适度稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。（用PBS液代替一抗作阴性对照）。 (7)PBS洗5min×3次。 (8)滴加生物素化的第二抗体，湿盒内温育30min。 (9)PBS洗5min×3次 (10)滴加ABC复合物或SABC复合物（皆于使用前新鲜配制），湿盒内温育30-60min。 (11)以后步骤同直接法(7)∼(11)步。 ABC法的优点是：敏感性强，特异性较强，背景染色淡，方法简单，节约时间，并且由于生物素与抗生物素具 有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。SABC法敏感性比ABC高4-8倍，特异性强，背景更清晰。 5.SP法（streptavidin-perosidase，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法） 步骤： (1)切片脱蜡至水。 (2)0.3%H2O2甲醇处理切片10-20min。 (3)PBS洗5min×3次。 (4)抗原修复。 (5)PBS洗5min×3次
(6)加入血清孵育10min (⑦)甩去血清,滴加第一抗体,孵育30-60min。(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照) (8)PBS洗5min×3次 (9)滴加第二抗体,孵育20min。 (10)PBS洗5min×3次。 (11)加入SP复合物孵育20-30min (12)PBS洗5min×3次。。 (13)DAB-H2O2显色,在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应。 (14)自来水冲洗。 (15) Harris苏木素染核5-10min。 (16)水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。 SP法是目前国内使用最广泛的一种方法,90年代初提出了用链卵蛋白素替代ABC法中的卵白素生物素复合物。 该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白,有四个和生物素亲和力极高的结合点。敏感性强,效果好,背景清 晰而无非特异性染色,阳性物突出,明显易辨,节省时间,抗体可以高度稀释,增加标记病例,降低成本 (三)结果判断及分析 由于影响染色结果的因素很多,如不同厂家生产的抗体特异性和敏感性不同、检测试剂盒特异性和敏感性不 同、技术熟练程度以及固定包埋组织处理的技术差异等,其结果判断标准化问题尚难统一,但一般应掌握以下原 阳性判定:在阳性对照为阳性结果,阴性对照出现阴性结果的前提下,阳性表达在细胞和组织特定的抗原部 位。即阳性细胞定位准确,是胞膜、胞浆还是胞核阳性,而且间质清晰,无背景着色。阳性细胞一般应在5%以上 可定位阳性,阳性结果有强弱、多少之分。 阴性判定:阳性对照为阳性结果,阴性对照出现阴性结果时,可初步确认。但阴性结果不能视为抗原不表 应该结合具体情况分析 由于抗体尚存在特异性与敏感性不足;或者内源性干扰、试剂不纯,交叉反应等:或者组织处理不当,组织细 胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、搓加、失效、变质等),操作失误等多种因素影响。实验结果会出现错误,或为 假阳性或为假阴性。假阳性是指实验切片呈阳性,阴性对照组织或阴性试剂对照也城阳性的结果。假阴性是指实验 切片呈阴性,阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果。因此,不能单纯依靠免疫酶细胞化学结果做出诊 断,必须以常规组织学改变为基础,结合组织化学染色、电镜、分子生物学检测等结果才能做出正确诊断。当免疫 酶细胞化学结果与常规切片诊断有矛盾时,一般以常规切片诊断为准
(6)加入血清孵育10min。 (7)甩去血清，滴加第一抗体，孵育30-60min。（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）； (8)PBS洗5min×3次。 (9)滴加第二抗体，孵育20min。 (10)PBS洗5min×3次。 (11)加入SP复合物孵育20-30min。 (12)PBS洗5min×3次。。 (13)DAB-H2O2显色，在DAB溶液中于显微镜下观察控制显色反应。 (14)自来水冲洗。 (15)Harris苏木素染核5-10min。 (16)水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。 SP法是目前国内使用最广泛的一种方法，90年代初提出了用链卵蛋白素替代ABC法中的卵白素生物素复合物。 该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物素亲和力极高的结合点。敏感性强，效果好，背景清 晰而无非特异性染色，阳性物突出，明显易辨，节省时间，抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。 （三）结果判断及分析 由于影响染色结果的因素很多，如不同厂家生产的抗体特异性和敏感性不同、检测试剂 盒特异性和敏感性不 同、技术熟练程度以及固定包埋组织处理的技术差异等，其结果判断 标准化问题尚难统一，但一般应掌握以下原 则： 阳性判定：在阳性对照为阳性结果，阴性对照出现阴性结果的前提下，阳性表达在细胞和组织特定的抗原部 位。即阳性细胞定位准确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性，而且间质清晰，无背景着色。阳性细胞一般应在5%以上， 可定位阳性，阳性结果有强弱、多少之分。 阴性判定：阳性对照为阳性结果，阴性对照出现阴性结果时，可初步确认。但阴性结果不能视为抗原不表达， 应该结合具体情况分析。 由于抗体尚存在特异性与敏感性不足；或者内源性干扰、试剂不纯，交叉反应等；或者组织处理不当，组织细 胞抗原丢失或试剂错误（如漏加、搓加、失效、变质等），操作失误等多种因素影响。实验结果会出现错误，或为 假阳性或为假阴性。假阳性是指实验切片呈阳性，阴性对照组织或阴性试剂对照也城阳性的结果。假阴性是指实验 切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果。因此，不能单纯依靠免疫酶细胞化学结果做出诊 断，必须以常规组织学改变为基础，结合组织化学染色、电镜、分子生物学检测等结果才能做出正确诊断。当免疫 酶细胞化学结果与常规切片诊断有矛盾时，一般以常规切片诊断为准
