病理标本的固定 固定就是把病理标本组织浸泡在适宜的化学试剂内,借助于化学试剂的作用,使组织或细胞内蛋白质凝聚、沉 淀或变性成为不溶性物质,并保持组织细胞原有的形态结构。所使用的化学试剂配成的溶液称为固定液。凡是需要 制作病理检验标本的各种组织,无论是制作切片标本,还是制作大体标本,首先必须固定。在制作切片过程中,固 定是最为重要的步骤,一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。 (一)固定的目的 1.抑制自溶和腐败组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止、或局部器官、组织 割离机体之后,组织细胞的代谢功能丧失,新鲜组织如果不经固定,任意放置,由于细胞内酶对蛋白质的分解,以 及细菌的孳生等各种因素的作用,则易因细菌繁殖而致组织腐烂与自溶。 2.保存细胞经过固定,不但能沉淀或凝固组织内的各种成份和病理代谢产物,如蛋白质、脂肪、糖类、色素 也可使其它碳水化合物、无机成份及微生物等经过固定而保存下来,并在制片过程中不为其他试剂溶解破坏,便于 染色后易于观察和鉴别。 3.硬化固定液兼有的硬化作用,能使柔软组织(如脑)的质地变硬,也能使胶质物体的固化,使细胞正常的半 液体状(溶胶)变为不能逆转的固体状(凝胶),便于制片操作 4.对染色的影响某些固定剂具有一定的媒染作用而増进染色,使组织细胞着色清晰,便于显微镜下的观察辨 (二)固定的方法及注意事项 1.固定必须及时,组织离体后,必须立即固定,一般固定在标本缸或广口瓶中。 2.固定液应该根据制作要求选择合适的固定液。最常用的固定液是10%福尔马林或10%中性福尔马林液。 3.固定组织时,应有足够的固定液,一般为组织块体积的10-15倍。固定液的浓度必须准确,过稀或过浓都会 影响固定的效果。 4.固定的时间,视组织的种类、性质、大小、固定液种类、性质等而定。一般已经固定过的大标本取材后应该 在室温下再固定6-8h,如果是新鲜大标本,最好固定24小时后再取材。已经固定过的小标本取材后应该在室温下再 固定2-4h,如果是新鲜小标本取材,必须再固定6-8min。低温固定(如4℃),时间需要更长。 (三)固定液的选择 理想的固定液应该具备下列几种性能: 1.渗透性强固定液必须能迅速渗入组织,这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置,而不致弥散。 2.组织在固定液的作用下,不应发生显著的收缩和膨胀现象。由于蛋白质发生凝固或沉淀,必然导致组织出现 不同程度的收缩或膨胀。因此,良好的固定液应尽量减少组织发生这类变化。 3.固定液应该有利组织切片和染色。①对固定后的组织应有利于染色剂的染色:②能将组织或细胞中某些必须 观察的成分予以充分固定而保存下来,以便染色 (四)常用的固定剂的种类 1.%甲醛液(10%福尔马林液)甲醛(HCH0)是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为 40%,易挥发,日久会自行分解,产生白色沉淀(副醛:多聚甲醛或三聚甲醛),并有甲酸产生,影响组织的固定和 细胞核的染色。长期保存应该加入少量的碳酸盐(碳酸镁、碳酸钠、碳酸钙)中和。甲醛是通过使蛋白质分子发生
病理标本的固定 固定就是把病理标本组织浸泡在适宜的化学试剂内，借助于化学试剂的作用，使组织或细胞内蛋白质凝聚、沉 淀或变性成为不溶性物质，并保持组织细胞原有的形态结构。所使用的化学试剂配成的溶液称为固定液。凡是需要 制作病理检验标本的各种组织，无论是制作切片标本，还是制作大体标本，首先必须固定。在制作切片过程中，固 定是最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。 （一） 固定的目的 1.抑制自溶和腐败组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止、或局部器官、组织 割离机体之后，组织细胞的代谢功能丧失，新鲜组织如果不经固定，任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解，以 及细菌的孳生等各种因素的作用，则易因细菌繁殖而致组织腐烂与自溶。 2.保存细胞经过固定，不但能沉淀或凝固组织内的各种成份和病理代谢产物，如蛋白质、脂肪、糖类、色素， 也可使其它碳水化合物、无机成份及微生物等经过固定而保存下来，并在制片过程中不为其他试剂溶解破坏，便于 染色后易于观察和鉴别。 3.硬化固定液兼有的硬化作用，能使柔软组织（如脑）的质地变硬，也能使胶质物体的固化，使细胞正常的半 液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶），便于制片操作。 4.对染色的影响某些固定剂具有一定的媒染作用而增进染色，使组织细胞着色清晰，便于显微镜下的观察辨 认。 （二） 固定的方法及注意事项 1.固定必须及时，组织离体后，必须立即固定，一般固定在标本缸或广口瓶中。 2.固定液应该根据制作要求选择合适的固定液。最常用的固定液是10%福尔马林或10%中性福尔马林液。 3.固定组织时，应有足够的固定液，一般为组织块体积的10-15倍。固定液的浓度必须准确，过稀或过浓都会 影响固定的效果。 4.固定的时间，视组织的种类、性质、大小、固定液种类、性质等而定。一般已经固定过的大标本取材后应该 在室温下再固定6-8h，如果是新鲜大标本，最好固定24小时后再取材。已经固定过的小标本取材后应该在室温下再 固定2-4h，如果是新鲜小标本取材，必须再固定6-8min。低温固定（如4℃），时间需要更长。 （三）固定液的选择 理想的固定液应该具备下列几种性能： 1.渗透性强固定液必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散。 2.组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象。由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然导致组织出现 不同程度的收缩或膨胀。因此，良好的固定液应尽量减少组织发生这类变化。 3.固定液应该有利组织切片和染色。①对固定后的组织应有利于染色剂的染色；②能将组织或细胞中某些必须 观察的成分予以充分固定而保存下来，以便染色。 （四）常用的固定剂的种类 1.4%甲醛液（10%福尔马林液） 甲醛（HCHO）是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为 40%，易挥发，日久会自行分解，产生白色沉淀(副醛：多聚甲醛或三聚甲醛)，并有甲酸产生，影响组织的固定和 细胞核的染色。长期保存应该加入少量的碳酸盐（碳酸镁、碳酸钠、碳酸钙）中和。甲醛是通过使蛋白质分子发生
交联而产生固定作用。我们用作固定的为4%甲醛水溶液(9份水加1份浓甲醛液,实际含甲醛4%,俗称10%福尔马 林液 2.↓%中性缓冲甲醛液(10%中性缓冲福尔马林液)对大多数抗原保存较好,是免疫组织化学最常用的固定液, 组织穿透性好,组织收缩小。固定时间以24h以内为宜 固定液配方1:40%甲醛10m1,0.01mol/LpH7.4的PBS90ml。 固定液配方2:40%甲醛10m,蒸馏水8m,磷酸二氢钠(P4·2o)4g,磷酸氢二钠(Naog 优点:①渗透能力强,固定均匀。②收缩小。③能保存脂肪和类脂(冰冻切片法)。④增加组织韧性。⑤有利 于嗜银染色。⑥可固定高尔基体和线粒体。 缺点:①不能沉淀核蛋白及白蛋白。②溶解组织内尿酸盐结晶。③经甲醛固定的陈旧组织较易产生色素沉淀 (去除方法:用 Schridde法:浓氨水1毫升加入75%乙醇200毫升内,切片脱蜡后处理30min,如还有再延长,流水冲 3.80%-95%乙醇为无色液体,可与水在任何比例下混合。它是一种还原剂,很易被氧化成乙醛,再变为醋酸, 所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。用于固定时以80%~95%的浓度为好。优点:①具有固定、硬化、 脱水等多种作用。②用无水乙醇固定时,其穿透速度很快,宜做糖原固定。缺点:①渗透力较弱,容易造成表面发 硬,较难渗透到组织深部。③能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,核蛋白被沉淀后仍能溶于水,故经乙醇固定的组 织,核的着色不良,不利于染色体的固定。④可溶解脂肪及类脂、血红蛋白和损害多种色素,所以要证明细胞内的 脂肪、类脂及色素的存在,不能用乙醇作为固定液 高浓度乙醇固定的组织硬化显著。组织在高浓度乙醇中留置过久,易变脆,也使组织收缩明显,约可缩小原体 积的20%。用7σ%乙醇可较久的保存组织。该液体一般只在没有福尔马林液的情况下,临时单独使用 4.丙酮为极易挥发易燃的无色液体,能与水、醇、氯仿、醚及多种液体混合。丙酮能使蛋白质沉淀,渗透能力 强,但对核固定欠佳,且使组织剧烈收缩。丙酮广泛应用于组织化学中的酶的固定,特别是用于磷酸酶、脂酶以及 氧化酶的固定。其作用基本与乙醇相同,但对糖原无固定作用。 5.醋酸纯醋酸为带刺激味的无色液体,在寒冷时常结成冰状故称冰醋酸,它可以各种比例与水和乙醇相混合, 固定组织常用5%的溶液,它不能沉淀白蛋白、球蛋白,但能沉淀核蛋白,所以对染色质固定很好。醋酸的穿透速度 很快,组织不会硬化,且可防止经乙醇时所引起的高度收缩及硬化。缺点是能使组织膨胀,若单独使用时,只能固 定极短时间,一般都与其他试剂配合使用。高浓度的醋酸会破坏高尔基体和线粒体,故在高尔基体和线粒体制片的 固定中不用醋酸 6. Carry液由冰醋酸l0ml,氯仿3m1.无水乙醇60m配制而成。能固定胞浆和胞核,尤其适宜于染色体等。常 用于糖原和尼氏体的固定,对显示DNA、RNA的效果较好。固定液可防止乙醇的硬化及收缩作用,增加渗透性,特别 适合外膜致密不易透入的组织 7. Bouin液饱和苦味酸水溶液τ5ml,甲醛水溶液25ml,冰醋酸5m配制而成。该液 渗透能力强,固定均匀且收缩较小,染色效果好。由于苦味酸难于溶解,故实验室内应储备一定的饱和苦味酸 水溶液。 Bouin液对绝大多数器官和组织固定良好,固定时间以12-24h为宜,固定后常用70%-80%乙醇洗涤。 8.乙醇、甲醛液(A-F液)由95%或无水乙醇90ml,(浓)甲醛10ml配制而成。此液兼有脱水作用,固定后可直 接入95%乙醇继续脱水。适用于皮下组织肥大细胞的固定
交联而产生固定作用。我们用作固定的为4％甲醛水溶液（9份水加1份浓甲醛液，实际含甲醛4％，俗称10%福尔马 林液）。 2.4%中性缓冲甲醛液（10%中性缓冲福尔马林液） 对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液， 组织穿透性好，组织收缩小。固定时间以24h以内为宜。 固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/LpH7.4的PBS 90ml。 固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4） 13g。 优点：①渗透能力强，固定均匀。②收缩小。③能保存脂肪和类脂（冰冻切片法）。④增加组织韧性。⑤有利 于嗜银染色。⑥可固定高尔基体和线粒体。 缺点：①不能沉淀核蛋白及白蛋白。②溶解组织内尿酸盐结晶。③经甲醛固定的陈旧组织较易产生色素沉淀。 （去除方法：用Schridde法：浓氨水1毫升加入75%乙醇200毫升内，切片脱蜡后处理30min，如还有再延长，流水冲 洗）。 3.80%-95%乙醇为无色液体，可与水在任何比例下混合。它是一种还原剂，很易被氧化成乙醛，再变为醋酸， 所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。用于固定时以80%～95%的浓度为好。优点：①具有固定、硬化、 脱水等多种作用。②用无水乙醇固定时，其穿透速度很快，宜做糖原固定。缺点：①渗透力较弱，容易造成表面发 硬，较难渗透到组织深部。③能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白被沉淀后仍能溶于水，故经乙醇固定的组 织，核的着色不良，不利于染色体的固定。④可溶解脂肪及类脂、血红蛋白和损害多种色素，所以要证明细胞内的 脂肪、类脂及色素的存在，不能用乙醇作为固定液。 高浓度乙醇固定的组织硬化显著。组织在高浓度乙醇中留置过久，易变脆，也使组织收缩明显，约可缩小原体 积的20%。用70%乙醇可较久的保存组织。该液体一般只在没有福尔马林液的情况下，临时单独使用。 4.丙酮为极易挥发易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、醚及多种液体混合。丙酮能使蛋白质沉淀，渗透能力 强，但对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。丙酮广泛应用于组织化学中的酶的固定，特别是用于磷酸酶、脂酶以及 氧化酶的固定。其作用基本与乙醇相同，但对糖原无固定作用。 5.醋酸纯醋酸为带刺激味的无色液体，在寒冷时常结成冰状故称冰醋酸，它可以各种比例与水和乙醇相混合， 固定组织常用5%的溶液，它不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白，所以对染色质固定很好。醋酸的穿透速度 很快，组织不会硬化，且可防止经乙醇时所引起的高度收缩及硬化。缺点是能使组织膨胀，若单独使用时，只能固 定极短时间，一般都与其他试剂配合使用。高浓度的醋酸会破坏高尔基体和线粒体，故在高尔基体和线粒体制片的 固定中不用醋酸。 6. Carroy液由冰醋酸10ml,氯仿30ml.无水乙醇60ml配制而成。能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常 用于糖原和尼氏体的固定，对显示DNA、RNA的效果较好。固定液可防止乙醇的硬化及收缩作用，增加渗透性，特别 适合外膜致密不易透入的组织。 7. Bouin液饱和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液25ml，冰醋酸5ml配制而成。该液 渗透能力强，固定均匀且收缩较小，染色效果好。由于苦味酸难于溶解，故实验室内应储备一定的饱和苦味酸 水溶液。Bouin液对绝大多数器官和组织固定良好，固定时间以12-24h为宜，固定后常用70%-80%乙醇洗涤。 8.乙醇、甲醛液（A-F液） 由95%或无水乙醇90ml,（浓）甲醛10ml配制而成。此液兼有脱水作用，固定后可直 接入95%乙醇继续脱水。适用于皮下组织肥大细胞的固定