常用试剂的配制 (一)缓冲液 1.0.01MPBS液(PH7.2)NaCl8g,Na2HPO41.15g,KH2P040.2g(NaH2P04,加双蒸水至1000ml。 2.0.05MTBS液(PH7.4)Tris(三羟甲基胺基甲烷)12.lg,Nacl17.5g,加双蒸水至1500m1,在搅拌下加 浓HCL至PH7.4,再加双蒸水至2000m1。 3.0.02MTBS液(PH8.2)Tris4.84g,Nacl17.5g,BSA2.0g,NaN31.0g,加双蒸水至1500ml,在搅拌 下加浓HCL至PH8.2,再加双蒸水至2000m1。(BSA一牛血清白蛋白;NaN3一叠氮钠,为防腐剂)。 4.0.05MTB液(PH7.6)先配制0.05MTB液:Tris60.75g,1NHCL约420ml,双蒸水至1000m1。 配制方法:先以少量双蒸水(300ml)溶解Tris,加入HCL后,再用1NHCL或 in NaOH将PH值调至7.6, 加双蒸水至1000m1。用时将0.5MTB稀释10倍,即为0.05MTB液(PH7.6)液 5.0.05M醋酸缓冲液(PH3.5)先配制0.IM的醋酸和醋酸钠溶液:0.IM醋酸液:冰醋酸5.75ml,双蒸水 加至1000ml。0.IM醋酸钠液:醋酸钠13.6g,双蒸水100om。再配制0.IM醋酸缓冲液0.IM醋酸210m0.IM醋 酸钠790ml,混合即可。用时将0.IM的醋酸缓冲液稀释5倍,即为0.05M醋酸缓冲液(PH5.2) 6.枸橼酸缓冲液 (1)PH3.5:枸橼酸2.55g,枸橼酸钠2.35g双蒸水加至100ml (②)PH6.0:21.0lg枸橼酸加入蒸馏水l000m10.M枸橼酸:29.41g枸橼酸钠加入蒸馏水1000ml0.1M枸橼 酸钠。使用时取0.1M枸橼酸9ml和0.IM枸橼酸钠4l皿l,再加入蒸馏水450ml,即配成0.01M的枸橼酸缓冲液 (PH6.0±0.1)。用于微波修复抗原时 (二)显色液 1.DAB① Diaminobenzidine)显色液DAB(3.3—二氨基联苯胺四盐酸盐)50mg 0.05MTB(或0.0MPBS)100m1,30%H20230-40μ1。 配制方法:先以少量0.05MTB(或0.01MPBS)溶解DAB,充分溶解后加入剩余的TB或PBS,摇匀后(避 光)过滤,显色前加入30%H202,宁少勿多,便于掌握反应过程。阳性为棕黄色颗粒。(DAB有致癌作用 操作时应格外小心,避免直接与皮肤接触,用后的器皿应充分冲洗,用后的DAB液不应冲入下水道,应集中 深埋或清洁液处理后弃之) 2.AEC(3- amino-9- ethy lcarbozloe)显色液AEC(3氨基-9-乙基卡巴唑)20mg,二甲酰胺(DMF) 2.5m1,0.05M醋酸缓冲液(PH5.5)50m1,30%H20225μ1。 配制方法:先将AEC溶于DM中,再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前加入30%H202液。镜下控制显色 时间。阳性为深红色颗粒 3.4-氯-1萘酚(4-CL-1- NapHthol)显色液4-氯-1萘酚100mg,无水乙醇10ml,0.05MTB(PH7.6) 190m1,30%H20210ul。 配制方法:先将4-氯-1萘酚溶于无水乙醇中,然后再加入TB190m1,用前加入30%202,显色时间5-20分 钟。阳性结果为蓝或深蓝色 4.α-萘酚显色液①α一萘酚AS-BI磷酸盐1mg,坚固红TR盐2ng,底物缓冲液2ml
常用试剂的配制 （一)缓冲液 1.0.01MPBS液(PH7.2) NaCl 8g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g（NaH2PO4，加双蒸水至1000ml。 2.0.05MTBS液(PH7.4) Tris(三羟甲基胺基甲烷) 12.1g，Nacl 17.5g，加双蒸水至1500ml，在搅拌下加 浓HCL至PH7.4，再加双蒸水至2000ml。 3.0.02MTBS液（PH8.2）Tris 4.84g，Nacl 17.5g，BSA 2.0g，NaN3 1.0g，加双蒸水至1500ml，在搅拌 下加浓HCL至PH8.2，再加双蒸水至2000ml。（BSA—牛血清白蛋白；NaN3—叠氮钠，为防腐剂）。 4.0.05MTB液（PH7.6）先配制0.05MTB液：Tris 60.75g，1N HCL约420ml，双蒸水至1000ml。 配制方法：先以少量双蒸水（300ml）溶解Tris，加入HCL后，再用1N HCL或1N NaOH将PH值调至7.6，再 加双蒸水至1000ml。 用时将0.5MTB稀释10倍，即为0.05MTB液（PH7.6）液。 5.0.05M醋酸缓冲液（PH3.5） 先配制0.1M的醋酸和醋酸钠溶液：0.1M醋酸液：冰醋酸5.75ml，双蒸水 加至1000ml。0.1M醋酸钠液：醋酸钠13.61g，双蒸水1000ml。再配制0.1M醋酸缓冲液0.1M醋酸210ml 0.1M醋 酸钠790ml，混合即可。用时将0.1M的醋酸缓冲液稀释5倍，即为0.05M醋酸缓冲液（PH5.2）。 6.枸橼酸缓冲液 (1)PH3.5：枸橼酸2.55g，枸橼酸钠2.35g双蒸水 加至100ml。 (2)PH6.0：21.01g枸橼酸加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼酸；29.41g枸橼酸钠加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼 酸钠。使用时取0.1M枸橼酸9ml和0.1M枸橼酸钠41ml，再加入蒸馏水450ml，即配成0.01M的枸橼酸缓冲液 （PH6.0±0.1）。用于微波修复抗原时。 (二）显色液 1.DAB (Diaminobenzidine)显色液 DAB（3.3—二氨基联苯胺四盐酸盐）50mg， 0.05MTB(或0.01MPBS) 100ml，30%H2O2 30-40μl。 配制方法：先以少量0.05MTB（或0.01MPBS）溶解DAB，充分溶解后加入剩余的TB或PBS，摇匀后（避 光）过滤，显色前加入30% H2O2，宁少勿多，便于掌握反应过程。阳性为棕黄色颗粒。（DAB有致癌作用， 操作时应格外小心，避免直接与皮肤接触，用后的器皿应充分冲洗，用后的DAB液不应冲入下水道，应集中 深埋或清洁液处理后弃之）。 2.AEC（3-amino-9-ethylcarbozloe）显色液 AEC（3-氨基- 9-乙基卡巴唑）20mg，二甲酰胺（DMF） 2.5ml，0.05M醋酸缓冲液（PH5.5）50ml，30% H2O2 25μl。 配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前加入30% H2O2液。镜下控制显色 时间。阳性为深红色颗粒。 3.4-氯-1萘酚（4-CL-1-NapHthol）显色液 4-氯-1萘酚100mg，无水乙醇10ml，0.05MTB（PH7.6） 190ml，30%H2O2 10μl。 配制方法：先将4-氯-1萘酚溶于无水乙醇中，然后再加入TB190ml，用前加入30%H2O2，显色时间5-20分 钟。阳性结果为蓝或深蓝色。 4.α-萘酚显色液①α-萘酚AS-BI磷酸盐1mg，坚固红TR盐2mg，底物缓冲液2ml
二甲基甲酰胺(DMF)40u1 配制方法:先将α-萘酚AS-BI磷酸盐溶于40μ1DWF中,再加入底物缓冲液21,临用前10分钟加坚固红 TR盐。 底物缓冲液(PH8.2-8.3):0.2 M Tris5oml,0. IM HCL4oml,Mg2CL·6H2020.3mg,左旋咪唑 20.4mg,双蒸水加至10oml。结果为玫瑰红色,若在底物显色液中用坚固兰B盐代替坚固红TR盐,终产物 为深蓝色。 5.α-萘酚显色液②α-萘酚AS-BI磷酸盐5ng,DMF0.05ml,丙二醇缓冲液(0.05M,PH9.8)5ml,坚牢 蓝BB2mg 配制方法:先将α-萘酚溶于DMF中,然后加入丙二醇缓冲液,临用前加入坚牢蓝BB,溶解过滤后使用。 丙二醇缓冲液(储备液):2mol/L:2-氨基-2-甲基-1.3丙二醇35.64g,6mol/LHCL32ml,0.005 M MgCL2 4ml,左旋咪唑480mg,双蒸水加至200ml,用HCL或NaOH调PH至9.8,取上述储备液lml用双蒸水稀释至40m 备用。阳性结果为蓝色颗粒 6.a-萘酚显色液③a-萘酚15mg,DMF0.5m1,坚固蓝BB盐30ng,0.05 M Tris-HCL(PH.1)50m1,左旋 咪唑12mg。 配制方法:先将α-萘酚溶于D中,加λ坚固蓝,再加λTris-HCL缓冲液,最后加λ左旋咪唑,完全溶 解过滤后立即使用。显色为37oC,15-30min,用0.1%中性红复染30-60s自来水冲洗,丙酮分化5秒钟,流水 冲洗。阳性结果为蓝色,细胞核为红色或紫色。 7.银显色液 (1)硝酸银显色液:①2%明胶(或25%阿拉伯胶水溶液60ml。②枸橼酸缓冲液(PH3.5)10m。③对苯二 酚1.7g加双蒸水至10ml。④硝酸银50ng加双蒸水至2ml。①~③液用前依次混合,最后加入④液,注意避 光 (2)乳酸银显色液:①20%阿拉伯胶60ml。②枸橼酸缓冲液(PH3.5)10ml。③对苯二酚0.85g/15ml。④乳 酸银110mg/15m1。以上①~③液用前依次混合,最后加④液,注意避光 上述两种显色液的25%阿拉伯胶可用双蒸水代替,但此时反应明显加快,镜下密切观察。 (3)醋酸银显色液:①硝酸银100mng/50ml双蒸水。②10%明胶10ml。③枸橼酸缓冲液(PH3.5)1.7g加双 蒸水至10m1。④对苯二酚600mg 配制方法:将对苯二酚溶于③液,然后将②③液混合过滤,再加入①液。 (三)酶消化液 1.0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶100mg,0.1%氯化钙(PH7.8)100ml。 配制方法:先配制0.1%氯化钙,用0.IM的NaOH将其PH值调至7.8,然后加入胰蛋白酶充分溶解。用前将 胰蛋白酶消化液在水溶中预热至37°C,消化时间10-30mina 2.0.4%胃蛋白酶胃蛋白酶400mg,0. IN HCL100ml。 配制方法:先配制0. IN HCL,然后将胃蛋白酶充分溶解,预热至37°C后使用,消化时间30分钟左右。 (四)粘合剂 1.铬矾明胶液铬矾(或甲铬矾)0.5g,明矾5g,蒸馏水1000m
二甲基甲酰胺（DMF）40μl。 配制方法：先将α-萘酚AS-BI磷酸盐溶于40μl DMF中，再加入底物缓冲液2l，临用前10分钟加坚固红 TR盐。 底物缓冲液（PH8.2-8.3）：0.2M Tris 50ml，0.1M HCL 40ml，Mg2CL·6 H2O 20.3mg，左旋咪唑 20.4mg，双蒸水 加至100ml。 结果为玫瑰红色，若在底物显色液中用坚固兰BB盐代替坚固红TR盐，终产物 为深蓝色。 5.α-萘酚显色液②α-萘酚AS-BI磷酸盐5mg，DMF 0.05ml，丙二醇缓冲液（0.05M，PH9.8）5ml，坚牢 蓝BB2mg。 配制方法：先将α-萘酚溶于DMF中，然后加入丙二醇缓冲液，临用前加入坚牢蓝BB，溶解过滤后使用。 丙二醇缓冲液（储备液）：2mol/L：2-氨基-2-甲基-1.3丙二醇35.64g，6mol/LHCL 32ml，0.005M MgCL2 4ml，左旋咪唑480mg，双蒸水 加至200ml，用HCL或NaOH调PH至9.8，取上述储备液1ml用双蒸水稀释至40ml 备用。阳性结果为蓝色颗粒。 6.α-萘酚显色液③ α-萘酚15mg，DMF0.5ml，坚固蓝BB盐30mg，0.05M Tris-HCL(PH9.1) 50ml， 左旋 咪唑12mg。 配制方法：先将α-萘酚溶于DMF中，加入坚固蓝，再加入Tris-HCL缓冲液，最后加入左旋咪唑，完全溶 解过滤后立即使用。显色为37oC，15-30min，用0.1%中性红复染30-60s自来水冲洗，丙酮分化5秒钟，流水 冲洗。 阳性结果为蓝色，细胞核为红色或紫色。 7.银显色液 ⑴硝酸银显色液： ①2%明胶（或25%阿拉伯胶水溶液60ml。②枸橼酸缓冲液（PH3.5）10ml。③对苯二 酚1.7g加双蒸水至10ml。④硝酸银50mg加双蒸水至2ml。 ①～③液用前依次混合，最后加入④液，注意避 光。 ⑵乳酸银显色液：①20%阿拉伯胶60ml。②枸橼酸缓冲液（PH3.5）10ml。③对苯二酚0.85g/15ml。④乳 酸银110mg/15ml。以上①～③液用前依次混合，最后加④液，注意避光。 上述两种显色液的25%阿拉伯胶可用双蒸水代替，但此时反应明显加快，镜下密切观察。 ⑶ 醋酸银显色液：①硝酸银100mg/50ml双蒸水。②10%明胶10ml。③枸橼酸缓冲液（PH3.5）1.7g加双 蒸水至10ml。④对苯二酚600mg。 配制方法：将对苯二酚溶于③液，然后将②③液混合过滤，再加入①液。 （三）酶消化液 1.0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶100mg，0.1%氯化钙（PH7.8）100ml。 配制方法：先配制0.1%氯化钙，用0.1M的NaOH将其PH值调至7.8，然后加入胰蛋白酶充分溶解。用前将 胰蛋白酶消化液在水溶中预热至37oC，消化时间10-30min。 2.0.4%胃蛋白酶胃蛋白酶400mg，0.1N HCL 100ml。 配制方法：先配制0.1N HCL，然后将胃蛋白酶充分溶解，预热至37oC后使用，消化时间30分钟左右。 （四）粘合剂 1.铬矾明胶液铬矾（或甲铬矾）0.5g，明矾5g，蒸馏水1000ml
配制方法:先将少许蒸馏水溶解铬矾(硫酸铬钾)后,再加入明胶及蒸馏水,于η0σC水溶液中胶溶化后 置电动磁力搅拌器上,持续搅拌均匀,如有沉渣可过滤后使用。 将清洁的载玻片置上述液体中浸泡数分钟后,烤干备用,可防止脱片 2.甲醛明胶液40%甲醛2.5ml,明胶0.5g,蒸馏水至100ml。 配制方法:将少许蒸馏水(约8om1)将明胶加热溶解,待完全溶解后,加入甲醛,最后补充蒸馏水至 100m1备用。用法同铬矾明胶液。 3.APES液APES1m1,丙酮50ml。 配制方法:取APES1ml,加丙酮50ml,充分搅拌均匀备用。将清洁的载玻片放入APES液中20~30秒后, 取出,用丙酮液洗去多余的APES液,注意不要留有气泡,晾干备用。经该方法处理的玻片具有良好的防脱片 能力 4.多聚赖氨酸液多聚赖氨酸lml,蒸馏水10ml。 配制方法:取市售多聚赖氨酸lml,加入蒸馏水10ml,置塑料容器中,将清洁的玻片放入该液中5分钟 取出放置无尘干燥箱中晾干备用或600C干燥箱烤干备用。所需容器不能用玻璃制品。经该方法处理的玻片具 有很强的粘合能力。但价格较APES贵得多。 (五)封固剂 1.缓冲甘油纯甘油(分析纯)20m1,0.5M碳酸缓冲液(PH9.5)20ml。 配制方法:取纯甘油20m1,加入碳酸缓冲液20ml,充分混合,待气泡完全消失后,即可使用 2.甘油-TBS(PBS)纯甘油90m1,0.01MTBS10ml;纯甘油75m1,0.0MPBS25m1。 配制方法:按上述比例将甘油和TBS(PBS)充分混合后,置4°C静置,待气泡完全消失后,即可使用。 3.甘油明胶明胶10g,甘油10ml,蒸馏水10oml,麝香草酚少许 配制方法:称取10g明胶于温热(40oC)的蒸馏水中,充分溶解后过滤,再加入12ml甘油混合均匀。少 许麝香草酚是为了防腐。 4.液体石蜡液体石蜡因含杂质少,很少引起非特异性荧光,故常用于免疫荧光时标本的封固 5. DPX Distrene10g,酞酸二丁酯5m1。二甲苯35ml。 DPX为中性封固剂,用于多种染色方法均不易褪色,但使组织收缩较明显,故应尽量使其为均匀的一薄 层 (六)复染剂 1. Mayer氏苏木素配制方法详见第一章第三节 2.甲基绿甲基绿2g,蒸馏水100m1,复染后水洗数次,常规脱水封片。 3.核固红核固红0.1g,硫酸铝15g,蒸馏水100ml。 配制方法:将核固红溶入15%硫酸铝水溶液中,加热溶解,冷却过滤后备用。复染后用流水冲洗数分钟 后,常规脱水封片
配制方法：先将少许蒸馏水溶解铬矾（硫酸铬钾）后，再加入明胶及蒸馏水，于70oC水溶液中胶溶化后 置电动磁力搅拌器上，持续搅拌均匀，如有沉渣可过滤后使用。 将清洁的载玻片置上述液体中浸泡数分钟后，烤干备用，可防止脱片。 2.甲醛明胶液 40%甲醛2.5ml，明胶0.5g，蒸馏水 至100ml。 配制方法：将少许蒸馏水（约80ml）将明胶加热溶解，待完全溶解后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至 100ml备用。用法同铬矾明胶液。 3.APES液 APES 1ml，丙酮50ml。 配制方法：取APES 1ml，加丙酮50ml，充分搅拌均匀备用。将清洁的载玻片放入APES液中20～30秒后， 取出，用丙酮液洗去多余的APES液，注意不要留有气泡，晾干备用。经该方法处理的玻片具有良好的防脱片 能力。 4.多聚赖氨酸液多聚赖氨酸1ml，蒸馏水10ml。 配制方法：取市售多聚赖氨酸1ml，加入蒸馏水10ml，置塑料容器中，将清洁的玻片放入该液中5分钟， 取出放置无尘干燥箱中晾干备用或60oC干燥箱烤干备用。所需容器不能用玻璃制品。经该方法处理的玻片具 有很强的粘合能力。但价格较APES贵得多。 （五）封固剂 1.缓冲甘油纯甘油（分析纯）20ml，0.5M碳酸缓冲液（PH9.5）20ml。 配制方法：取纯甘油20ml，加入碳酸缓冲液20ml，充分混合，待气泡完全消失后，即可使用。 2.甘油-TBS（PBS）纯甘油90ml，0.01MTBS 10ml；纯甘油75ml，0.01MPBS 25ml。 配制方法：按上述比例将甘油和TBS（PBS）充分混合后，置4oC静置，待气泡完全消失后，即可使用。 3.甘油明胶明胶10g，甘油10ml，蒸馏水100ml，麝香草酚少许。 配制方法：称取10g明胶于温热（40oC）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少 许麝香草酚是为了防腐。 4.液体石蜡液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于免疫荧光时标本的封固。 5.DPX Distrene 10g，酞酸二丁酯5ml。二甲苯35ml。 DPX为中性封固剂，用于多种染色方法均不易褪色，但使组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄 层。 （六）复染剂 1.Mayer氏苏木素配制方法详见第一章第三节。 2.甲基绿甲基绿2g，蒸馏水100ml，复染后水洗数次，常规脱水封片。 3.核固红核固红0.1g， 硫酸铝15g，蒸馏水100ml。 配制方法：将核固红溶入15%硫酸铝水溶液中，加热溶解，冷却过滤后备用。复染后用流水冲洗数分钟 后，常规脱水封片
