涂片制作技术 (-)标本采集方法 标本采集是细胞病理学诊断成败的首要因素,标本采集不当,固定不佳,必然影响诊断结果。常用采集方法 1.直接采集法用刮片、吸管吸取、擦拭或刷洗方法直接采集体表或外界相通器官的病变,直接收集人体排泄 物、分泌物或渗出物等。 2.灌洗法向空腔器官灌注一定量生理盐水等液体,运用冲洗,振动、揉捏等方法使空腔器官中的某些细胞包括 癌细胞脱落于其中,然后将灌洗液取出,取离心后沉淀物检査。 3.擦刷法采用擦刷工具(如海绵摩擦器、线网套、气囊、纤支镜刷等)对鼻咽部、食管、胃肠道等处病灶刷擦 取材涂片。如食管拉网法对食管癌检出率高,简便易行。 4.穿刺法利用穿刺术抽取体腔液以及经阴道后穹窿穿出子宫直肠窝液体等。 。5细针穿刺法利用细针吸取某些深在部位组织或器官(如淋巴结、骨关节、软组织、甲状腺、乳腺、肝、胰等 乎所有器官均可进行)及包块的细胞材料进行涂片检查 标本注意事项: 尽可能自病变区直接采取细胞,标本力求新鲜,避免自溶。 2.浅表病变可采用表面涂片或刮片法:脏器病变可收集自然分泌物,摩擦或内镜指示下刷取或吸取涂片法;对 人体深部及实质性肿块可通过穿刺涂片。 3.所有采集标本应有足够的细胞数量以提供诊断 4.每例玻片需要编码或做好标记,按规定填写完整的临床细胞学检査申请单。对临床送检的涂片,做好标本和 送检单等査对验收工作,统一编号登记。对送检体液标本应记录色泽、性状和数量。发现干枯、自溶标本以及与申 请单不符合要求的标本不与接收检查。 5.严格避免标本彼此污染,检査前要求使用干净的器具和载玻片,有的要经特殊处理。固定器具定期清洗。 6.需做细胞学免疫标记的标本,要求载玻片预处理,涂好防脱片胶,获得的标本经均匀涂片后,将玻片置于密 封盒中保存在-20度冷柜内备用或及时送检 (二)涂片方法 良好的制片是细胞诊断学的重要前提,也是细胞学重要基本技能。涂片要求保证标本新鲜,尽快制片;操作要 轻巧,以防损伤细胞:涂片要均匀,厚薄适度:以镜下各视野布满细胞、间隙少,无明显重叠为合适。注意涂片是 否挤压,以防细胞损伤变形。一般标本涂片在玻片右侧2/3范围内,左侧1/3贴标签。对于缺乏蛋白质的液体标本, 制片时先在玻片上涂上黏附剂,以防细胞从玻片上脱落 基本涂片制备方法包括: 1.推片法适用于稀薄检查标本。检査标本置于玻片右侧端,推片与载玻片成30°角,检査标本夹于二玻片之 间轻轻向左推。 2.涂抹法适用于稍稠标本,用竹签或小镊子将检材拨散涂匀。常用转圈涂抹法和往复法,前者由玻片中心开 始,以顺时针的方向向外转圈均匀涂抹;后者从玻片一端开始,与玻片平行涂抹。涂抹比盖片稍窄些
涂片制作技术 （一)标本采集方法 标本采集是细胞病理学诊断成败的首要因素，标本采集不当，固定不佳，必然影响诊断结果。常用采集方法： 1.直接采集法用刮片、吸管吸取、擦拭或刷洗方法直接采集体表或外界相通器官的病变，直接收集人体排泄 物、分泌物或渗出物等。 2.灌洗法向空腔器官灌注一定量生理盐水等液体，运用冲洗，振动、揉捏等方法使空腔器官中的某些细胞包括 癌细胞脱落于其中，然后将灌洗液取出，取离心后沉淀物检查。 3.擦刷法采用擦刷工具（如海绵摩擦器、线网套、气囊、纤支镜刷等）对鼻咽部、食管、胃肠道等处病灶刷擦 取材涂片。如食管拉网法对食管癌检出率高，简便易行。 4.穿刺法利用穿刺术抽取体腔液以及经阴道后穹窿穿出子宫直肠窝液体等。 5.细针穿刺法利用细针吸取某些深在部位组织或器官（如淋巴结、骨关节、软组织、甲状腺、乳腺、肝、胰等 几乎所有器官均可进行）及包块的细胞材料进行涂片检查。 标本注意事项： 1.尽可能自病变区直接采取细胞，标本力求新鲜，避免自溶。 2.浅表病变可采用表面涂片或刮片法；脏器病变可收集自然分泌物，摩擦或内镜指示下刷取或吸取涂片法；对 人体深部及实质性肿块可通过穿刺涂片。 3.所有采集标本应有足够的细胞数量以提供诊断。 4.每例玻片需要编码或做好标记，按规定填写完整的临床细胞学检查申请单。对临床送检的涂片，做好标本和 送检单等查对验收工作，统一编号登记。对送检体液标本应记录色泽、性状和数量。发现干枯、自溶标本以及与申 请单不符合要求的标本不与接收检查。 5.严格避免标本彼此污染，检查前要求使用干净的器具和载玻片，有的要经特殊处理。固定器具定期清洗。 6.需做细胞学免疫标记的标本，要求载玻片预处理，涂好防脱片胶，获得的标本经均匀涂片后，将玻片置于密 封盒中保存在-20度冷柜内备用或及时送检。 （二）涂片方法 良好的制片是细胞诊断学的重要前提，也是细胞学重要基本技能。涂片要求保证标本新鲜，尽快制片；操作要 轻巧，以防损伤细胞；涂片要均匀，厚薄适度；以镜下各视野布满细胞、间隙少，无明显重叠为合适。注意涂片是 否挤压，以防细胞损伤变形。一般标本涂片在玻片右侧2/3范围内，左侧1/3贴标签。对于缺乏蛋白质的液体标本， 制片时先在玻片上涂上黏附剂，以防细胞从玻片上脱落。 基本涂片制备方法包括： 1.推片法 适用于稀薄检查标本。检查标本置于玻片右侧端，推片与载玻片成30°角，检查标本夹于二玻片之 间轻轻向左推。 2.涂抹法 适用于稍稠标本，用竹签或小镊子将检材拨散涂匀。常用转圈涂抹法和往复法，前者由玻片中心开 始，以顺时针的方向向外转圈均匀涂抹；后者从玻片一端开始，与玻片平行涂抹。涂抹比盖片稍窄些
3.压拉法适用于较黏稠液体或块标本的制片。将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间,然后移动上下玻片,使 其重叠,再边压边拉,一次可得两张涂片。 4.喷射法适用于各种吸取的液体标本制片。距玻片2~3cm高处,将吸管内的标本反复喷射在玻片上,喷射涂 抹要均匀,每边距离片缘2cm为宜 5.印片法为活体组织检查的辅助方法。将切取的病变组织块,用手术刀切开,立即将切面平放于玻片上,轻 轻按印。 6.自动涂片机用机器进行自动制片。如液基细胞学技术( liquid basedcytology,LBC),是一种半自动或全 自动标本处理新技术,将刷取或灌洗法采集的标本,放在特殊的运送液或保存液中,制成细胞悬液,经过进一步处 理,除去血液、蛋白和炎性渗出物,制成分布均匀的薄片。其优点是:①涂片上细胞分布均匀、分布范围小、背景 清晰。②标本筛査简便、快速。③能提髙诊断灵敏度和特异度。④能显著降低标本的不满意率。⑤能用于原位杂交 和免疫细胞化学染色。LBC技术是对传统标本处理方法的有效补充,但对某些非妇科标本,因LBC涂片缺乏背景成 分,会影响细胞学诊断 (三)固定方法 细胞学标本制成涂片后要立即固定。目的主要是保持细胞形态尽量与生活时相似,防止细胞自溶和细菌所致腐 败。固定愈及时,细胞愈新鲜,染色效果愈好。固定方法: 1.湿固定涂片不待干燥,即放入固定液内,细胞着色鲜艳,结构清晰。适宜用巴氏染色或染色。在痰、阴道 和食管拉网涂片中较常用。 2.干固定待涂片稍干后再放入固定液,适用端氏( Wright)、姬姆萨( Giemasa)染色。 因固定液和标本性质不同而异,一般需要固定15-30min以上。 常用固定液: 1.等量95%乙醇和乙醚混合液95%乙醇49.5m1,乙醚49.5m1,冰醋酸1.0m1 2.氯仿乙醇固定液( Carnoy固定液)无水乙醇60ml,氯仿30m1,冰醋酸10ml。 3.95%乙醇固定液 4.福尔马林固定液福尔马林原液稀释5-10倍。多聚甲醛(用于原位PCR) (四)染色方法 巴氏( Papanicoloan)染色的操作方法 1.试剂配制 (1) Harris苏木素染液(配l00om1)苏木素5g,95%乙醇50ml,亚明矾(硫酸铝氨)100g,蒸馏水1000ml,黄 色氧化汞2.5g。详见第一章第三节 (2)橘黄Gδ取橘黄G0.5g溶解于5ml蒸馏水中,完全溶解后加入无水乙醇至100m,再加入0.015g磷钨酸。使用 前过滤,存储在深棕色瓶中 (3)EA36溶液配制为三种染料配合而成,先配制原液(常备液)。 ①淡绿:0.5g溶在5ml蒸馏水中,可温水浴使之完全溶解,然后把无水乙醇加至100ml ②伊红:0.5g溶于5m1蒸馏水,然后加无水乙醇至100ml。 ③俾氏麦棕:0.5g溶于5m1蒸馏水,然后加无水乙醇至100m1
3.压拉法 适用于较黏稠液体或块标本的制片。将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间，然后移动上下玻片，使 其重叠，再边压边拉，一次可得两张涂片。 4.喷射法 适用于各种吸取的液体标本制片。距玻片2～3cm高处，将吸管内的标本反复喷射在玻片上，喷射涂 抹要均匀，每边距离片缘2cm为宜。 5.印片法 为活体组织检查的辅助方法。将切取的病变组织块，用手术刀切开，立即将切面平放于玻片上，轻 轻按印。 6.自动涂片机用机器进行自动制片。如液基细胞学技术（liquid basedcytology，LBC），是一种半自动或全 自动标本处理新技术，将刷取或灌洗法采集的标本，放在特殊的运送液或保存液中，制成细胞悬液，经过进一步处 理，除去血液、蛋白和炎性渗出物，制成分布均匀的薄片。其优点是：①涂片上细胞分布均匀、分布范围小、背景 清晰。②标本筛查简便、快速。③能提高诊断灵敏度和特异度。④能显著降低标本的不满意率。⑤能用于原位杂交 和免疫细胞化学染色。LBC技术是对传统标本处理方法的有效补充，但对某些非妇科标本，因LBC涂片缺乏背景成 分，会影响细胞学诊断。 （三）固定方法 细胞学标本制成涂片后要立即固定。目的主要是保持细胞形态尽量与生活时相似，防止细胞自溶和细菌所致腐 败。固定愈及时，细胞愈新鲜，染色效果愈好。固定方法： 1.湿固定涂片不待干燥，即放入固定液内，细胞着色鲜艳，结构清晰。适宜用巴氏染色或HE染色。在痰、阴道 和食管拉网涂片中较常用。 2.干固定待涂片稍干后再放入固定液，适用端氏（Wright）、姬姆萨（Giemasa）染色。 因固定液和标本性质不同而异，一般需要固定15-30min以上。 常用固定液： 1.等量95%乙醇和乙醚混合液 95%乙醇49.5ml，乙醚49.5ml，冰醋酸1.0ml。 2.氯仿乙醇固定液（Carnoy固定液）无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。 3.95%乙醇固定液。 4.福尔马林固定液福尔马林原液稀释5-10倍。多聚甲醛（用于原位PCR）。 （四）染色方法 巴氏（Papanicoloan）染色的操作方法 1.试剂配制 (1)Harris苏木素染液（配1000ml） 苏木素5g，95%乙醇50ml，亚明矾（硫酸铝氨）100g，蒸馏水1000ml，黄 色氧化汞2.5g。详见第一章第三节。 (2)橘黄G6 取橘黄G 0.5g溶解于5ml蒸馏水中，完全溶解后加入无水乙醇至100ml，再加入0.015g磷钨酸。使用 前过滤，存储在深棕色瓶中。 (3)EA36溶液配制为三种染料配合而成，先配制原液（常备液）。 ①淡绿：0.5g溶在5ml蒸馏水中，可温水浴使之完全溶解，然后把无水乙醇加至100ml。 ②伊红：0.5g溶于5ml蒸馏水，然后加无水乙醇至100ml。 ③俾氏麦棕：0.5g溶于5ml蒸馏水，然后加无水乙醇至100ml
再将以上试剂按下述比例混合:淡绿常备液45l,伊红常备液45m,俾氏麦棕常备液10ml。最后将磷钨酸0.2g 溶于少许蒸馏水中加入混合液中,然后再加碳酸锂饱和溶液一滴。 (4)EA31液淡绿常备液50m1伊红常备液40ml,磷钨酸0.17g余者同EA36。 (5)EA65液与EA36相比含淡绿成分一半份量 (6)EA50液3%淡绿10ml,纯甲醇250ml,20%伊红Y20ml,冰醋酸20ml,磷钨酸2.0g,95%乙醇700ml。 2.常规染色步骤 (1)将固定好的涂片投入95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水或自来水中,各2min (2) Harris苏木素液浸染3-5min (3)自来水中冲洗3-5min (4)0.25%-0.5%盐酸水溶液分化1-2s (5)自来水洗1-2s。 (6)稀碳酸锂(l00ml蒸馏水中加碳酸锂饱和液1滴)返蓝30s,自来水洗3min (7)依次置入70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇各lmin (8)橘黄G6液0.5-1min (9)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1min (10)置入入EA类染液(EA36、EA31、EA50、EA65)选其中一种染色3-5min (11)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各lmin (12)无水乙醇I、Ⅱ各1min (13)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2min (14)中性树胶封固 3.染色结果胞核为蓝紫色,核仁深紫色。鱗状上皮细胞表层完全角化细胞为橘黄色;表层不完全角化细胞为粉 红色:中层和外底层细胞为浅绿色和浅蓝色:内底层细胞为蓝灰色 高分化鳞癌细胞可染成粉红色或橘黄色:腺癌胞浆为蓝灰色。 中性粒细胞和淋巴细胞,吞噬细胞浆均为蓝色。 红细胞为粉红色,嗜酸性粒细胞浆内颗粒仍为红色。 该染色方法具有多色性染色特性,色彩多样且鲜艳,细胞核结构清晰,胞浆颗粒分明,涂片染色的透明性好 细胞的角度与细胞重叠不影响检査。适用于上皮细胞染色,尤适用于鳞状上皮的分化程度的观察,如阴道涂片观察 女性激素水平 4注意事项 (1)苏木素液用前须过滤,补充少许新液,以使涂片无苏木素沉渣并保证苏木素液维持足够浓度。 (2)苏木素染液提前月余配制,待苏木精充分氧化为苏木素
再将以上试剂按下述比例混合：淡绿常备液45ml，伊红常备液45ml，俾氏麦棕常备液10ml。最后将磷钨酸0.2g 溶于少许蒸馏水中加入混合液中，然后再加碳酸锂饱和溶液一滴。 (4)EA31液淡绿常备液50ml伊红常备液40ml，磷钨酸0.17g余者同EA36。 (5)EA65液与EA36相比含淡绿成分一半份量。 (6)EA50液 3%淡绿10ml，纯甲醇250ml，20%伊红Y20ml，冰醋酸20ml，磷钨酸2.0g，95%乙醇700ml。 2.常规染色步骤 (1)将固定好的涂片投入95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水或自来水中，各2min。 (2)Harris苏木素液浸染3-5min。 (3)自来水中冲洗3-5min。 (4)0.25%-0.5%盐酸水溶液分化1-2s。 (5)自来水洗1-2s。 (6)稀碳酸锂（100ml蒸馏水中加碳酸锂饱和液1滴）返蓝30s,自来水洗3min。 (7)依次置入70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇各1min。 (8)橘黄G6液0.5-1min。 (9)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1min。 (10)置入入EA类染液（EA36、EA31、EA50、EA65)选其中一种染色3-5min。 (11)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各1min。 (12)无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1min。 (13)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2min。 (14)中性树胶封固。 3.染色结果胞核为蓝紫色，核仁深紫色。鳞状上皮细胞表层完全角化细胞为橘黄色；表层不完全角化细胞为粉 红色；中层和外底层细胞为浅绿色和浅蓝色；内底层细胞为蓝灰色。 高分化鳞癌细胞可染成粉红色或橘黄色；腺癌胞浆为蓝灰色。 中性粒细胞和淋巴细胞，吞噬细胞浆均为蓝色。 红细胞为粉红色，嗜酸性粒细胞浆内颗粒仍为红色。 该染色方法具有多色性染色特性，色彩多样且鲜艳，细胞核结构清晰，胞浆颗粒分明，涂片染色的透明性好， 细胞的角度与细胞重叠不影响检查。适用于上皮细胞染色，尤适用于鳞状上皮的分化程度的观察，如阴道涂片观察 女性激素水平。 4.注意事项 (1)苏木素液用前须过滤，补充少许新液，以使涂片无苏木素沉渣并保证苏木素液维持足够浓度。 (2)苏木素染液提前月余配制，待苏木精充分氧化为苏木素
(3)天气冷苏木素不易着色时,可加温染色,但不要超过50℃ (4)分化是染色的关键步骤,深染时在酸液中多浸1~2s,淡染时在酸液中少浸1~2s,应充分返蓝后。 5)橘黄G浸染不宜过长,并置于95%乙醇中洗净多余染液,否则影响EA类染液着色 苏木素一伊红染色(HE染色) 染色透明度好,核浆对比鲜明,染色效果稳定,方法简便,技术易掌握,广泛用于各种细胞学染色,特别用于 黏液较多的痰液涂片,但多彩性不及巴氏染色。详见第一章第三节 瑞氏一姬姆萨染色 1.试剂配制 (1)瑞氏一姬姆萨复合染液:瑞氏粉lg,姬姆萨粉lg,甲醇400m,甘油100m。先将染料放入乳钵内,加入 loml甘油硏磨成糊状,然后将染液置λ棕色瓶中,用甲醇将剩余的染料反复硏磨,重复多次,直至将甲醇全部用完 为止,再将剩余甘油全部倒入瓶中,配制后的染液必须在37℃恒温箱内放置1周,每天摇动混匀2次,存放时间越 长,染色效果更佳。 (2)缓冲液(pH6.4-6.8):KH2PO40.3g,Na2HPO40.2g,蒸馏水1000m1 2.染色步骤 (1)将固定好的涂片滴加瑞氏一姬姆萨复合染液适量 (2)染色1min后加缓冲液适量。 (3)5-10min后倾去染液 (4)自来水冲洗,待干,封固。 3.染色结果细胞及核染色颗粒分色清晰。该方法操作简便,对胞浆中的颗粒与核染色质结构显示较为清晰,适 用于血液、骨髓的细胞学检査。但染色质量不够稳定,核着色不够深,胞浆及胞膜不易着色
(3)天气冷苏木素不易着色时，可加温染色，但不要超过50℃。 (4)分化是染色的关键步骤，深染时在酸液中多浸1～2s，淡染时在酸液中少浸1～2s，应充分返蓝后。 (5)橘黄G浸染不宜过长，并置于95%乙醇中洗净多余染液，否则影响EA类染液着色。 苏木素—伊红染色（HE染色） 染色透明度好，核浆对比鲜明，染色效果稳定，方法简便，技术易掌握，广泛用于各种细胞学染色，特别用于 黏液较多的痰液涂片，但多彩性不及巴氏染色。详见第一章第三节。 瑞氏—姬姆萨染色 1.试剂配制 (1)瑞氏—姬姆萨复合染液：瑞氏粉1g，姬姆萨粉1g，甲醇400ml，甘油100ml。先将染料放入乳钵内，加入 10ml甘油研磨成糊状，然后将染液置入棕色瓶中，用甲醇将剩余的染料反复研磨，重复多次，直至将甲醇全部用完 为止，再将剩余甘油全部倒入瓶中，配制后的染液必须在37℃恒温箱内放置1周，每天摇动混匀2次，存放时间越 长，染色效果更佳。 (2)缓冲液（pH6.4-6.8）：KH2PO40.3g，Na2HPO40.2g,蒸馏水1000ml。 2.染色步骤 (1)将固定好的涂片滴加瑞氏—姬姆萨复合染液适量。 (2)染色1min后加缓冲液适量。 (3)5-10min后倾去染液。 (4)自来水冲洗，待干，封固。 3.染色结果细胞及核染色颗粒分色清晰。该方法操作简便，对胞浆中的颗粒与核染色质结构显示较为清晰，适 用于血液、骨髓的细胞学检查。但染色质量不够稳定，核着色不够深，胞浆及胞膜不易着色