232 大连水产学院学报 第21卷 添加剂的用量",每日灌服1次。灌服前将黄芪水煎剂按不同浓度稀释,使每组试验鱼均按每100 g鱼体重灌服0.3mL药液,相当于黄芪(干物质)的用量分别为日投喂饲料重量的0.5%(A组)、 1.0%(B组)和2.0%(C组),对照组灌服灭菌蒸馏水。连续灌服两周后对全部试验鱼统一采样。 于试验鱼尾动静)脉处采集肝素抗凝血,4℃下以3500r/min离心20min,取血浆。解剖取鱼各组 织的样品,将血浆及组织样品立即置于70℃下保存 1.3各项指标的测定 1.3.Ⅰ样品的处理准确称取试验鱼组织样品与预冷的生理盐水,按ν冲=1稀释,匀浆机匀浆 分别按不同检测指标及试剂盒所要求的速度和时间离心,取上清液进行检测。血浆在37℃下水浴融 化后即可检测。每个检测指标的样本数n=15,溶菌酶检测的样本数n=20,均设平行样。 1.3.2NO及NOS的测定取肝脏上清液及血浆,操作按NO及NOS试剂盒说明书进行 组织中NOS活力单位定义每亳克组织蛋白每分钟生成1 moi No为一个酶活力单位 血浆中NOS活力单位定义每毫升血浆每分钟生成1 MoNO为一个酶活力单位 1.3.3SOD活性的测定参照其它动物测定SOD的取样量,设定N个样品取样值,从中选取几个样 本,按试剂盒说明书操作,测定其样品管及对照管的吸光值。按下式计算百分抑制率 百分抑制率=(对照管吸光度3测定管吸光度)照管吸光度 其计算结果在0.48~0.50之间的为最佳取样量。选择此最佳取样量,按试剂盒说明书对待测样本进 行SOD活性测定。 血浆中SOD活性定义每毫升反应液中,对SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD 活力单位(U)。 组织匀浆中SOD活力定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中,对SOD抑制率达50%时所对应 的SOD量为一个SOD活力单位(U)。 1.3.4MDA含量的测定按MDA测定试剂盒中的操作方法对试验鱼血浆、肝组织中的MDA含量进 行测定。 1.3.5溶菌酶含量的测定取微球菌粉加入0.01mol的BS,研磨,制成5mg/mL的微球菌粉贮 备菌液,4℃下保存,一周内可用。测定时按中贮备菌液)冲(溶剂)=1:29的量稀释成应用菌 液。取溶菌酶标准品加蒸馏水配成2mg/mL的标准品贮备液(保存同贮备菌液),用时以蒸馏水稀释 50倍,即成40μg/mL的标准品应用液。 将试管放入冰水浴中,每管加入应用菌液2.0mL,然后在标准管中加入0.2mL的溶菌酶标准品 应用液,测定管中加入组织匀浆上清液陬取109%组织,于4℃下匀浆,以10000rmn离心20min) 混匀后,测定吸光度A。将比色后的溶液立即倒回到冰水浴的试管中,将试管取出,37℃下水浴30 min后,立即取试管放入冰水浴中,于530m处测定吸光度A1。然后将吸光度A换算成透光度T(r 1/104),根据下列公式计算出溶菌酶的含量 (样品7,3样品70) 样品中溶菌酶含量(gm或gB“标准品r,标准品)×标准管浓度烊样本稀释倍数 其中:T—水浴后吸光度A换算出的透光度;T—水浴前吸光度A换算出的透光度 1.3.6组织中蛋白质含量的测定采用考马斯亮兰蛋白测试盒测定肝组织提取液中的蛋白质含量 1.3.7数据处理对数据结果采用SPSS软件最小显著差数法①LS)进行处理 2结果 2.1黄芪水煎剂对史氏鲟血浆及肝脏中NO及NOS的影响 从表1可见,给史氏鲟灌服不同剂量的黄芪水煎剂后,其血浆中的NO及NOS虽然较对照组略有 上升,但差异不显著(P>0.05);B组及C组鱼肝脏中的NO与对照组相比差异显著(P<0.05) 而C组鱼肝脏中的NOS与对照组相比差异也显著(P<0.05) 91994-2007ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net添加剂的用量 [ 4 - 6 ] , 每日灌服 1次。灌服前将黄芪水煎剂按不同浓度稀释 , 使每组试验鱼均按每 100 g鱼体重灌服 013 mL药液 , 相当于黄芪 (干物质 ) 的用量分别为日投喂饲料重量的 015% (A组 )、 110% (B组 ) 和 210% (C组 ) , 对照组灌服灭菌蒸馏水。连续灌服两周后对全部试验鱼统一采样。 于试验鱼尾动 (静 ) 脉处采集肝素抗凝血 , 4℃下以 3 500 r/m in离心 20 m in, 取血浆。解剖取鱼各组 织的样品 , 将血浆及组织样品立即置于 - 70℃下保存。 113 各项指标的测定 11311 样品的处理 准确称取试验鱼组织样品与预冷的生理盐水 , 按 w∶φ = 1∶9稀释 , 匀浆机匀浆 , 分别按不同检测指标及试剂盒所要求的速度和时间离心 , 取上清液进行检测。血浆在 37℃下水浴融 化后即可检测。每个检测指标的样本数 n = 15, 溶菌酶检测的样本数 n = 20, 均设平行样。 11312 NO及 NOS的测定 取肝脏上清液及血浆 , 操作按 NO及 NOS试剂盒说明书进行。 组织中 NOS活力单位定义 每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NO为一个酶活力单位。 血浆中 NOS活力单位定义 每毫升血浆每分钟生成 1 nmol NO为一个酶活力单位。 11313 SOD活性的测定 参照其它动物测定 SOD的取样量 , 设定 N 个样品取样值 , 从中选取几个样 本 , 按试剂盒说明书操作 , 测定其样品管及对照管的吸光值。按下式计算百分抑制率 : 百分抑制率 = (对照管吸光度 ∃ 测定管吸光度 ) /对照管吸光度 , 其计算结果在 0148～0150之间的为最佳取样量。选择此最佳取样量 , 按试剂盒说明书对待测样本进 行 SOD活性测定。 血浆中 SOD活性定义 每毫升反应液中 , 对 SOD抑制率达 50%时所对应的 SOD量为一个 SOD 活力单位 (U)。 组织匀浆中 SOD活力定义 每毫克组织蛋白在 1 mL反应液中 , 对 SOD抑制率达 50%时所对应 的 SOD量为一个 SOD活力单位 (U)。 11314 MDA含量的测定 按 MDA测定试剂盒中的操作方法对试验鱼血浆、肝组织中的 MDA含量进 行测定。 11315 溶菌酶含量的测定 取微球菌粉加入 010 1 mol/L的 PBS, 研磨 , 制成 5 mg/mL的微球菌粉贮 备菌液 , 4℃下保存 , 一周内可用。测定时按 φ (贮备菌液 ) ∶φ (溶剂 ) = 1∶29的量稀释成应用菌 液。取溶菌酶标准品加蒸馏水配成 2 mg/mL的标准品贮备液 (保存同贮备菌液 ) , 用时以蒸馏水稀释 50倍 , 即成 40μg/mL的标准品应用液。 将试管放入冰水浴中 , 每管加入应用菌液 210 mL, 然后在标准管中加入 012 mL的溶菌酶标准品 应用液 , 测定管中加入组织匀浆上清液 (取 10%组织 , 于 4℃下匀浆 , 以 10 000 r/m in离心 20 m in)。 混匀后 , 测定吸光度 A0。将比色后的溶液立即倒回到冰水浴的试管中 , 将试管取出 , 37℃下水浴 30 m in后 , 立即取试管放入冰水浴中 , 于 530 nm处测定吸光度 At。然后将吸光度 A换算成透光度 T ( T = 1 /10 A ) , 根据下列公式计算出溶菌酶的含量 : 样品中溶菌酶含量 (μg/mL或 μg/g) = (样品 Tt ∃ 样品 T0 ) (标准品 Tt - 标准品 T0 ) ×标准管浓度 ×样本稀释倍数 , 其中 : Tt ———水浴后吸光度 At换算出的透光度; T0 ———水浴前吸光度 A0换算出的透光度。 11316 组织中蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰蛋白测试盒测定肝组织提取液中的蛋白质含量。 11317 数据处理 对数据结果采用 SPSS软件最小显著差数法 (LSD) 进行处理。 2 结果 211 黄芪水煎剂对史氏鲟血浆及肝脏中 NO及 NOS的影响 从表 1可见 , 给史氏鲟灌服不同剂量的黄芪水煎剂后 , 其血浆中的 NO及 NOS虽然较对照组略有 上升 , 但差异不显著 ( P > 0105) ; B组及 C组鱼肝脏中的 NO与对照组相比差异显著 ( P < 0105) , 而 C组鱼肝脏中的 NOS与对照组相比差异也显著 ( P < 0105)。 232 大 连 水 产 学 院 学 报 第 21卷