华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第九章) 主讲教师:柳俊博士、教授 1.干燥法( desiccation) 2.预培养法( pregrowth) 3.预培养-干燥法( pregrowth-desiccation) 4.包埋脱水法( encapsulation- dehydration) 第四节影响超低温保存效果的主要因素 材料的基本特性 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态 不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。 、预培养和低温锻炼 预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料,减少了细 胞内自由水的含量,使细胞能经受低温胁迫,减少或避免了冷冻伤害,可大大提高材料的抗 冻力。 、冰冻保护剂的应用 般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以,生 物体的低温保存离不开冰冻保护剂( cryoprotective agent,CPA)。冰冻保护剂也称作抗冻 剂,合理地选择冰冻保护剂,对低温保存至关重要 冰冻保护剂应具有以下特点:易溶于水,对细胞无毒,容易从组织细胞中清除。冰冻保 护剂的作用主要表现在增加膜透性,加速细胞内的水流到细胞外结冰,稳定细胞膜结构,阻 止低温伤害,降低冰点,提高溶液的粘滞性,阻止冰晶生长, 渗透型冰冻保护剂:多属低分子中性物质,在溶液中易结合水分子,发生水合作用,使 溶液的粘性增加,从而弱化了水的结晶过程,达到保护的目的。常用的滲透型冰冻保护剂有 甘油、二甲亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、乙酰胺、丙二醇(PG)等。但渗透型冰冻保 护剂使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同,如甘油适宜于慢速冷 却,而DMSO却易于渗入细胞,并在常温下稍有毒性。 非渗透型冰冻保护剂:能溶于水,但不能进入细胞,它使溶液呈过冷状态,可在特定温 度下降低溶质(电解质)浓度,从而起到保护作用。非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯 烷酮( polyvinyl pyrolidone,PVP)、蔗糖( sucrose)、葡聚糖(右旋糖酐, dextrane) 聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)、白蛋白(albυumin)、羟乙基淀粉( hydroxyethyl starch,HES)等。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。 四、化冻方法 液泡小、含水量少的细胞(如茎尖分生组织),可采用快速化冻的方法。液泡大、含水 量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法 生长季节中的材料,一般在37~40%℃温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。 木本植物的冬芽,在超低温保存后,必须在0°C低温下进行慢速化冻才能达到良好的效 果。华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第九章) 主讲教师：柳俊博士、教授 1．干燥法（desiccation） 2．预培养法（pregrowth） 3．预培养-干燥法(pregrowth-desiccation) 4．包埋脱水法（encapsulation-dehydration） 第四节 影响超低温保存效果的主要因素 一、材料的基本特性 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。 不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。 二、预培养和低温锻炼 预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细 胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗 冻力。 三、冰冻保护剂的应用 一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以，生 物体的低温保存离不开冰冻保护剂（cryoprotective agent，CPA）。冰冻保护剂也称作抗冻 剂，合理地选择冰冻保护剂，对低温保存至关重要。 冰冻保护剂应具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保 护剂的作用主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻 止低温伤害，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。 渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使 溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。常用的渗透型冰冻保护剂有 甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但渗透型冰冻保 护剂使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷 却，而 DMSO 却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性。 非渗透型冰冻保护剂：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温 度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯 烷酮（polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）、 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、白蛋白（albumin）、羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）等。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。 四、化冻方法 液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水 量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。 生长季节中的材料，一般在 37～40ºC 温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。 木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在 0ºC 低温下进行慢速化冻才能达到良好的效 果