华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第九章) 主讲教师:柳俊博士、教授 理论上讲,细胞外水的冻结温度为-5~-15°,细胞内游离水的冻结在-25℃。-30 ℃C时,细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在,而结合水在一100%℃温度下也不冻结。根据 Luyet的冻结理论( Luyet1937),细胞游离水的冻结温度(-30°C)可被认为是细胞冻存的 安全温度,因而细胞冻存的两步冻结法是以一30C为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞超低温保存过程中的致死损伤 细胞超低温保存有三个重要操作步骤:一是细胞预冻;二是细胞在-196℃下长期贮 存;三是细胞解冻。 植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功 的关键,在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此,针对不同种类的植物材料,筛选适合 的冰冻保护剂,采用适当的降温冰冻速度和化冻方式,可能使细胞不受损伤或使损伤减小到 最低程度。 第三节超低温保存的方法 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处 理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 、传统的降温冰冻方法 1.快速冰冻法 2.慢速冰冻法 3.两步法 4.逐级冰冻法 、玻璃化保存方法 玻璃化( vitrification)是指液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程 使溶液玻璃化有两条途径:一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度 玻璃化法 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后,直接投入液氮,使生物材 料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变,进入玻璃态。此间水分子没有发生重排,不形成冰晶, 也不产生结构和体积的改变,因而不会对材料造成伤害。保存终止后,复温时要快速化冻, 防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口,就可保证冻存的成功 2.包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋一脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋,然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保 存,其材料存活率比用包埋一脱水法要髙,可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 、其它超低温冻存方法华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第九章) 主讲教师:柳俊博士、教授 理论上讲,细胞外水的冻结温度为-5~-15ºC,细胞内游离水的冻结在-25ºC。-30 ºC 时,细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在,而结合水在-100ºC 温度下也不冻结。根据 Luyet的冻结理论(Luyet 1937),细胞游离水的冻结温度(-30ºC)可被认为是细胞冻存的 安全温度,因而细胞冻存的两步冻结法是以-30ºC 为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。 二、植物细胞超低温保存过程中的致死损伤 细胞超低温保存有三个重要操作步骤:一是细胞预冻;二是细胞在-196ºC 下长期贮 存;三是细胞解冻。 植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功 的关键,在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此,针对不同种类的植物材料,筛选适合 的冰冻保护剂,采用适当的降温冰冻速度和化冻方式,可能使细胞不受损伤或使损伤减小到 最低程度。 第三节 超低温保存的方法 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处 理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 一、传统的降温冰冻方法 1.快速冰冻法 2.慢速冰冻法 3.两步法 4.逐级冰冻法 二、玻璃化保存方法 玻璃化(vitrification)是指液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径:一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度。 1.玻璃化法 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后,直接投入液氮,使生物材 料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变,进入玻璃态。此间水分子没有发生重排,不形成冰晶, 也不产生结构和体积的改变,因而不会对材料造成伤害。保存终止后,复温时要快速化冻, 防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口,就可保证冻存的成功。 2.包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋-脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋,然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保 存,其材料存活率比用包埋—脱水法要高,可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 三、其它超低温冻存方法