华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第九章) 主讲教师:柳俊博士、教授 理论上讲,细胞外水的冻结温度为-5~-15°,细胞内游离水的冻结在-25℃。-30 ℃C时,细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在,而结合水在一100%℃温度下也不冻结。根据 Luyet的冻结理论( Luyet1937),细胞游离水的冻结温度(-30°C)可被认为是细胞冻存的 安全温度,因而细胞冻存的两步冻结法是以一30C为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞超低温保存过程中的致死损伤 细胞超低温保存有三个重要操作步骤:一是细胞预冻;二是细胞在-196℃下长期贮 存;三是细胞解冻。 植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功 的关键,在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此,针对不同种类的植物材料,筛选适合 的冰冻保护剂,采用适当的降温冰冻速度和化冻方式,可能使细胞不受损伤或使损伤减小到 最低程度。 第三节超低温保存的方法 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处 理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 、传统的降温冰冻方法 1.快速冰冻法 2.慢速冰冻法 3.两步法 4.逐级冰冻法 、玻璃化保存方法 玻璃化( vitrification)是指液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程 使溶液玻璃化有两条途径:一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度 玻璃化法 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后,直接投入液氮,使生物材 料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变,进入玻璃态。此间水分子没有发生重排,不形成冰晶, 也不产生结构和体积的改变,因而不会对材料造成伤害。保存终止后,复温时要快速化冻, 防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口,就可保证冻存的成功 2.包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋一脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋,然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保 存,其材料存活率比用包埋一脱水法要髙,可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 、其它超低温冻存方法华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第九章) 主讲教师：柳俊博士、教授 理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5～－15ºC，细胞内游离水的冻结在－25ºC。－30 ºC 时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在－100ºC 温度下也不冻结。根据 Luyet的冻结理论（Luyet 1937），细胞游离水的冻结温度（－30ºC）可被认为是细胞冻存的 安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法是以－30ºC 为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。 二、植物细胞超低温保存过程中的致死损伤 细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在－196ºC 下长期贮 存；三是细胞解冻。 植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功 的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此，针对不同种类的植物材料，筛选适合 的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式，可能使细胞不受损伤或使损伤减小到 最低程度。 第三节 超低温保存的方法 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处 理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 一、传统的降温冰冻方法 1．快速冰冻法 2．慢速冰冻法 3．两步法 4．逐级冰冻法 二、玻璃化保存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。 1．玻璃化法 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材 料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶， 也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后，复温时要快速化冻， 防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。 2．包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保 存，其材料存活率比用包埋—脱水法要高，可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 三、其它超低温冻存方法