试管号Cr终浓度(moL)Cr加入量(m) 7.5 0.52 0.344 2.0 0.208 对各试液调p至90,最后用水调节体积至50ml,分别测活。对上述数据进行双 倒数作图法处理,即用1/V对1Cr]作图(V=13×△A97),可求得表观Km(Cr)和Vmax 3.DINB修饰肌酸激酶的反应动力学及酶表面可反应硫基数及总巯基数的测定 蛋白质分子中的巯基与5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)DTNB)反应如下 反应结果为每当蛋白质分子中修饰掉一个-SH,就产生一个芳硫负离子,芳硫负离 子在412nm处有光吸收,根据其摩尔吸光系数:ε=13600Lmol-lcm-1,可以计算被 修饰的巯基数。 (1)修饰反应动力学: 取10ml酶溶液(~1mg/m置于微量比色皿中,加入10μDINB溶液(l0mmol/L) 立即监测412nm处光吸收(A412)随时间变化的动力学过程。由于DINB的浓度[DINB] >>[E]酶浓度,所以修饰反应是伪一级反应。用(Ax-A)(Ax-A0)对时间进行半 对数作图,求出反应的速度常数 (2)肌酸激酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定: 用微量比色皿分别测定没有变性剂和有变性剂存在下,酶溶液与DINB溶液充分反 应后的A412,按下式计算反应的巯基数,有变性剂的是总巯基数,变性剂可用SDS或262 试管号 Cr 终浓度(mol/L) Cr 加入量(ml) 1 20 2.08 2 10 1.04 3 7.5 0.78 4 5.0 0.52 5 3.3 0.344 6 2.0 0.208 对各试液调 pH 至 9.0，最后用水调节体积至 5.0ml，分别测活。对上述数据进行双 倒数作图法处理，即用 1/V 对 1/［Cr］作图(V=1.3×△A597)，可求得表观 Km (Cr)和 Vmax 。 3. DTNB 修饰肌酸激酶的反应动力学及酶表面可反应巯基数及总巯基数的测定： 蛋白质分子中的巯基与 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应如下： 反应结果为每当蛋白质分子中修饰掉一个-SH，就产生一个芳硫负离子，芳硫负离 子在 412nm 处有光吸收，根据其摩尔吸光系数：ε＝13600 L. mol－1. cm －1，可以计算被 修饰的巯基数。 ⑴ 修饰反应动力学： 取 1.0ml 酶溶液(～1mg/ml)置于微量比色皿中，加入 10l DTNB 溶液（10mmol/L）， 立即监测 412nm 处光吸收(A412 )随时间变化的动力学过程。由于 DTNB 的浓度［DTNB］ ＞＞［E］酶浓度，所以修饰反应是伪一级反应。用(A－Ａt)/( A－Ａ0)对时间进行半 对数作图，求出反应的速度常数。 ⑵ 肌酸激酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定： 用微量比色皿分别测定没有变性剂和有变性剂存在下，酶溶液与 DTNB 溶液充分反 应后的 A412，按下式计算反应的巯基数，有变性剂的是总巯基数，变性剂可用 SDS 或