主要基因检测方法原理及优缺点 (-PCR PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可以看作 是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。在存在DNA模 板、引物、dNTPs、.适当缓冲液(Mg2+)的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下， 对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板DNA与引物之间的变 性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。 普通PCR原理图 口0Ls物UU可 HHPHBHH五 果2%，GC 模板DNA dTTP 加热经90-95℃ 加热经90-95℃ UU口0U0可(D#)加A经90-95C 0monnouon 1加热经55-60℃ H出UUUg 重复 D0ooonnHHH 加热至70-75℃ H出UU元 3 y HHHH 子代DNA HHH出五之会世参 最初的普通PC技术只能通过对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分 析，实现简单的定性分析，这是第一代PCR。鉴于(1)第一代PCR采用的核酸燃料对实 验人员及环境造成较大伤害，(2)PC完成之后开盖检测易污染造成假阳性结果，(3)检测 耗时长且操作麻烦易出错及(4)只能做定性检测，二代PC得以发展并成为目前国内PCR 技术主流。 第二代PCR就是荧光定量PCR技术(Real-Time PCR),也叫做qPCR,是指通过应用荧 光染料或荧光标记的特异性探针如Tagman Probe),在PCR反应体系中加入荧光基团对 聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合软件对荧光信号进行分析，实 现基因检测的定性和定量分析。qPC常用于传染病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物 疗效考核，遗传疾病诊断。随着反应循环次数的增加，被扩增目的基因片段呈指数增长，通 过实时检测对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得C值，利用已知模板浓度的标准品作 对照，即可得出待测标本目的基因数。由于PCR定量过程通过Ct值间接反映，因此称为 第二代PCR。 实时荧光定量PCR原理图主要基因检测方法原理及优缺点 （一）PCR PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，可以看作 是生物体外的特殊 DNA 复制，其最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。在存在 DNA 模 板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2+) 的反应混合物中，在热稳定 DNA 聚合酶的催化下， 对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板 DNA 与引物之间的变 性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标 DNA 片段得以扩增。 普通 PCR 原理图 最初的普通 PCR 技术只能通过对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分 析，实现简单的定性分析，这是第一代 PCR。鉴于（1）第一代 PCR 采用的核酸燃料对实 验人员及环境造成较大伤害，（2）PCR 完成之后开盖检测易污染造成假阳性结果，（3）检测 耗时长且操作麻烦易出错及（4）只能做定性检测，二代 PCR 得以发展 并成为目前国内 PCR 技术主流。 第二代 PCR 就是荧光定量 PCR 技术（Real-Time PCR），也叫做 qPCR，是指通过应用荧 光染料或荧光标记的特异性探针(如 Taqman Probe)，在 PCR 反应体系中加入荧光基团对 聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合软件对荧光信号 进行分析，实 现基因检测的定性和定量分析。qPCR 常用于传染病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物 疗效考核，遗传疾病诊断。随着反应循环次数的增加，被扩增目的基因片段呈指数增长，通 过实时检测对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得 Ct 值，利用已知模板浓度的标准品作 对照，即可得出待测标本目的基因数。由于 rPCR 定量过程通过 Ct 值间接反映，因此称为 第二代 PCR。 实时荧光定量 PCR 原理图