第五章高效液相色谱法 一、概论 以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。最早的液相色 谱法是用菊根粉的吸附柱来分离植物的提取物，用石油醚淋洗，植物提取物中的成分以不同 速度向下移动，分离成许多颜色带排列在柱上，这些黄色、绿色的色柱称为色层谱。后来， 不仅用于有色物质，也可用于分离无色物质，这种借助于移动速度不同而法到分离和鉴定的 技术随若生产和研究的需要不断地发展 经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于 1O0μm,柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高，每根柱只能使用1次：流动相由柱管上 端依靠重力向下流过柱子，分离速度慢：各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进 行定，效率很低，分析速度很慢。40年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快。 重复性差_难以进行定量测定。直到60年代初吉丁斯和.C.Gidd ngs)将气相色谱理论修正 于液相色谱， 为其现代化 理论生 ,以后在技术上采 效固 相和 高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化：这种色谱技术称为高效液 相色谱法。和经典柱色谱法相比，具有以下特点： 1.高压流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱， 必须施加高压 一0可达150一300kg/cm2 2.高速使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为1一10ml/mi,使样本的分离 速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟 3.高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效可达50000塔 板/m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。 4.高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外检测器，最小 检测量可达1×10g」 5.高度自动 利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化 6.流出组分容易收集高效液相色谱法和气相色增法都是重要的分离分析方法，它们 在许多方面是相同和相似的，但也存在若差异。它们的应用领域不同。在己知的化合物中， 只有20%可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80%一85%：气 相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析： 高效液相色谱可分离和分折不挥发的 热稳定性差的以及离子型的农药，而 且样本前处理 ,70年代至80年代初期、农药分析 大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善 地配备了气相色谱仪和操作人员。目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定 的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的 主要障碍一一检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含 量通常是百分之几。多数农药分子结枸中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定 的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。测定样本时，使用定量的进样环利 自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱法。 国际农药分析协作委员会(CPAC出版发行的CIPAC农药分析手册共有I、IA、B、IC 和D五卷。1985年出版的1C卷和气相色增法约26个，液相色谱法约有20个：1988年出 版的D拳中36个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色法有16个，液相 色谐法有17个： 1989年5月CIPAC第33届年 会 上讨论通过10个农药 分析方法，其中就 有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等6个农药采用液相色谱法。从以上统计数 字看：日前液相色谱法在农药分析中己和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后， 可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。随着液 第五章 高效液相色谱法 一、概论 以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。最早的液相色 谱法是用菊根粉的吸附柱来分离植物的提取物，用石油醚淋洗，植物提取物中的成分以不同 速度向下移动，分离成许多颜色带排列在柱上，这些黄色、绿色的色柱称为色层谱。后来， 不仅用于有色物质，也可用于分离无色物质，这种借助于移动速度不同而达到分离和鉴定的 技术随着生产和研究的需要不断地发展。 经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于 l00µm，柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高，每根柱只能使用 1 次；流动相由柱管上 端依靠重力向下流过柱子，分离速度慢；各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进 行测定，效率很低，分析速度很慢。40 年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快， 但重复性差，难以进行定量测定。直到 60 年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正 后用于液相色谱，为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效固定相和 高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化；这种色谱技术称为高效液 相色谱法。和经典柱色谱法相比，具有以下特点： 1．高压 流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱， 必须施加高压。一般可达 150 一 300 kg／cm2。 2．高速 使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为 1—10 m1／min，使样本的分离 速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。 3．高效 使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效可达 50000 塔 板／m 以上，有时一根柱子可同时分离 100 种以上的组分。 4．高灵敏度 应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外检测器，最小 检测量可达 l×10—9g。 5．高度自动化 利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化。 6．流出组分容易收集 高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们 在许多方面是相同和相似的，但也存在着差异。它们的应用领域不同。在已知的化合物中， 只有 20％可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的 80％一 85％；气 相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；高效液相色谱可分离和分折不挥发的， 热稳定性差的以及离子型的农药，而且样本前处理简便。70 年代至 80 年代初期、农药分析 大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善 地配备了气相色谱仪和操作人员。目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定 的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的 主要障碍——检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含 量通常是百分之几。多数农药分子结构中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定 的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。测定样本时，使用定量的进样环和 自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱法。 国际农药分析协作委员会(CIPAC)出版发行的 CIPAC 农药分析手册共有 I、IA、IB、IC 和 D 五卷。1985 年出版的 IC 卷和气相色谱法约 26 个，液相色谱法约有 20 个；1988 年出 版的 D 卷中 36 个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色谱法有 16 个，液相 色谱法有 17 个；1989 年 5 月 CIPAC 第 33 届年会上讨论通过 10 个农药分析方法，其中就 有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等 6 个农药采用液相色谱法。从以上统计数 字看：日前液相色谱法在农药分析中已和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后， 可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。随着液