华南农业大学：《农药残留分析》课程教学资源（教案讲义）第五章高效液相色谱法.doc_大学文库

第五章高效液相色谱法一、概论以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。最早的液相色谱法是用菊根粉的吸附柱来分离植物的提取物，用石油醚淋洗，植物提取物中的成分以不同速度向下移动，分离成许多颜色带排列在柱上，这些黄色、绿色的色柱称为色层谱。后来，不仅用于有色物质，也可用于分离无色物质，这种借助于移动速度不同而法到分离和鉴定的技术随若生产和研究的需要不断地发展经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于 1O0μm,柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高，每根柱只能使用1次：流动相由柱管上端依靠重力向下流过柱子，分离速度慢：各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进行定，效率很低，分析速度很慢。40年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快。重复性差_难以进行定量测定。直到60年代初吉丁斯和.C.Gidd ngs)将气相色谱理论修正于液相色谱，为其现代化理论生 ,以后在技术上采效固相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化：这种色谱技术称为高效液相色谱法。和经典柱色谱法相比，具有以下特点： 1.高压流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱，必须施加高压一0可达150一300kg/cm2 2.高速使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为1一10ml/mi,使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟 3.高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效可达50000塔板/m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。 4.高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外检测器，最小检测量可达1×10g」 5.高度自动利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化 6.流出组分容易收集高效液相色谱法和气相色增法都是重要的分离分析方法，它们在许多方面是相同和相似的，但也存在若差异。它们的应用领域不同。在己知的化合物中，只有20%可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80%一85%：气相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析：高效液相色谱可分离和分折不挥发的热稳定性差的以及离子型的农药，而且样本前处理 ,70年代至80年代初期、农药分析大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善地配备了气相色谱仪和操作人员。目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的主要障碍一一检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含量通常是百分之几。多数农药分子结枸中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。测定样本时，使用定量的进样环利自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱法。国际农药分析协作委员会(CPAC出版发行的CIPAC农药分析手册共有I、IA、B、IC 和D五卷。1985年出版的1C卷和气相色增法约26个，液相色谱法约有20个：1988年出版的D拳中36个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色法有16个，液相色谐法有17个： 1989年5月CIPAC第33届年会上讨论通过10个农药分析方法，其中就有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等6个农药采用液相色谱法。从以上统计数字看：日前液相色谱法在农药分析中己和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后，可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。随着液

第五章高效液相色谱法一、概论以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相色谱法。最早的液相色谱法是用菊根粉的吸附柱来分离植物的提取物，用石油醚淋洗，植物提取物中的成分以不同速度向下移动，分离成许多颜色带排列在柱上，这些黄色、绿色的色柱称为色层谱。后来，不仅用于有色物质，也可用于分离无色物质，这种借助于移动速度不同而达到分离和鉴定的技术随着生产和研究的需要不断地发展。经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内，吸附剂粒径大于 l00µm，柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高，每根柱只能使用 1 次；流动相由柱管上端依靠重力向下流过柱子，分离速度慢；各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进行测定，效率很低，分析速度很慢。40 年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快，但重复性差，难以进行定量测定。直到 60 年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正后用于液相色谱，为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化；这种色谱技术称为高效液相色谱法。和经典柱色谱法相比，具有以下特点： 1．高压流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱，必须施加高压。一般可达 150 一 300 kg／cm2。 2．高速使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为 1—10 m1／min，使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。 3．高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效可达 50000 塔板／m 以上，有时一根柱子可同时分离 100 种以上的组分。 4．高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外检测器，最小检测量可达 l×10—9g。 5．高度自动化利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化。 6．流出组分容易收集高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们在许多方面是相同和相似的，但也存在着差异。它们的应用领域不同。在已知的化合物中，只有 20％可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的 80％一 85％；气相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；高效液相色谱可分离和分折不挥发的，热稳定性差的以及离子型的农药，而且样本前处理简便。70 年代至 80 年代初期、农药分析大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善地配备了气相色谱仪和操作人员。目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的主要障碍——检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含量通常是百分之几。多数农药分子结构中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。测定样本时，使用定量的进样环和自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱法。国际农药分析协作委员会(CIPAC)出版发行的 CIPAC 农药分析手册共有 I、IA、IB、IC 和 D 五卷。1985 年出版的 IC 卷和气相色谱法约 26 个，液相色谱法约有 20 个；1988 年出版的 D 卷中 36 个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色谱法有 16 个，液相色谱法有 17 个；1989 年 5 月 CIPAC 第 33 届年会上讨论通过 10 个农药分析方法，其中就有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等 6 个农药采用液相色谱法。从以上统计数字看：日前液相色谱法在农药分析中已和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后，可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。随着液

相色谱技术的发展和普及，更多的农药将会使用液相色谱法进行分析。此外，高效液相色谱法和气相色谱法使用的流动相不同，亦存在以下差别 (山气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氨气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对色谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择性，因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。而液相色谱的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载样本组分通过色谱住和进入检测器外，还参与色过程：在液相色谱中除通过变固定相改分离效果 ,通常用改变动相组成来改善分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全不同的分离， (2)液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。 (4)液体的粘度比气体的粘度大2一3个数量级，所以液相色谱的柱长通常不超过30m, 而气相色谱可采用长柱，填充柱的长度为0.5一3m,空心柱柱长可达几十米。 (5液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在气相色谱中与载气体积有关的参数都必须进行校正本章将讨论高效液相色谱的基本理论，色谱分离类型、流动相、检测器及其在农药分析中的应用。 “、基本原理高效液相色谱的基本理论可参阅有关书籍，它是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，加以改进而发展的。本书不再介绍与气相色谱有关的基本理论。使用液相色谱的最终日的是要求在最短时间内，使样本获得最好的分离和分析因此分离度是最主要的。本节将从基本理论上探讨如何在最少的时间内获得最好的分离 (一)选择性（分离因子）色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。它是两个组分净保留时间的比（即相对保留值）或两个组分的平衡分配之比。 1: 1 45 6 时(in, 图5-1高效液相色诗国

相色谱技术的发展和普及，更多的农药将会使用液相色谱法进行分析。此外，高效液相色谱法和气相色谱法使用的流动相不同，亦存在以下差别： (1)气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氦气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对色谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择性，因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。而液相色谱的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载样本组分通过色谱住和进入检测器外，还参与色谱分离过程；在液相色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来改善分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全不同的分离。 (2)液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。 (3)农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小 4—5 个数量级，所以在高效液相色谱中必须特别注意柱外效应对分离的不良彤响。 (4)液体的粘度比气体的粘度大 2—3 个数量级，所以液相色谱的柱长通常不超过 30cm，而气相色谱可采用长柱，填充柱的长度为 0.5—3m，空心柱柱长可达几十米。 (5)液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在气相色谱中与载气体积有关的参数都必须进行校正。本章将讨论高效液相色谱的基本理论，色谱分离类型、流动相、检测器及其在农药分析中的应用。二、基本原理高效液相色谱的基本理论可参阅有关书籍，它是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，加以改进而发展的。本书不再介绍与气相色谱有关的基本理论。使用液相色谱的最终日的是要求在最短时间内，使样本获得最好的分离和分析，因此分离度是最主要的。本节将从基本理论上探讨如何在最少的时间内获得最好的分离。 (一)选择性(分离因子) 色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。它是两个组分净保留时间的比(即相对保留值)或两个组分的平衡分配之比

V——保留体积； t——保留时间； W——为峰宽； h——为峰高根据图 5－1 的两个峰，选择性可用下式表示： 2 0 2 1 0 1 ( ) t t k t t k  －选择性＝＝－（5－1） t0 为溶剂保留时间，t1 和 t2 为峰 1 和峰 2 的保留时间，式中 kl 和 k2 是农药 1 和 2 的分配系数。 K 化合物在固定相中的浓度分配系数＝化合物在移动相中的浓度（5－2）（二）容量因子某一特定化合物在色谱柱上的容量因子是衡量该柱对此化合物的保留特性，是化合物的保留体积与死体积之比，根据图 5—1，峰 1 的容量因子为： 1 0 0 ' v v K v －＝（容量因子）＝（5－3）可改写为 1 0 0 ' t t K t －＝（5－4）因此，一个化合物的容量因子亦是该化合物的净保留时间与非滞留时间之比。 (三)柱效柱效是衡量某一特定色谱柱对化合物的谱带展宽度和改善分离的能力，用理论塔板数来表示，根据图 5—1，理论塔板数(N)可用下式表示： 2 1 2 1 ( ) 16 ( ) t N w ＝（5－5）根据式(5—5)，谱带宽度随 t 成正比地增大，洗脱的谱带宽度增加，高度下降。因半峰宽易测量准确，计算的 N 值也比较准确，可用 W0.5 来表示。 2 1 2 0.5 ( ) 5.54 ( ) t N w ＝（5－6）实际计算时，使用理论塔板的相当高度 HETP（或 H）较方便，它也是柱效率的量度。 L HETP N ＝（5－7） L 为柱的长度，H 小则 N 大，即柱效高。在气相色谱中已提及范·提姆特 Van Deemter 公式，总结的影响理论板高度的因素为： H＝A＋B/u＋Cu （5—8）其中 u 为流动相的线速度，B／u 为纵向分子扩散项，是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动。B＝2vDf，v 为一个常数，因此 H 与扩散系数(Df)成正比，与流动相的线速(u) 成反比。在气相色谱中，气体有较大的扩散系数，而分子在液相色谱中的扩散系数是很小的，比气体中小约 4—5 个数量级，因此在液相色谱中，纵向扩展的影响是可以忽略不计的，而气相色谱中这一项很重要。液相色谱中式(5—8)可简化为：

H=A+C. (5一0) A为涡流扩散项，它表示柱内填充剂的均匀性，颗粒直径和流动相流速等对样品分子所引起的涡流扩散影响，颗粒小而均匀，或组分在流动相中扩散系数大，则涡流扩散小分离效能高，Cu为传质速率项，组分在流动相和固定相中迅速达到平衡，才能形成较窄的谱带，如流动相流速快，组分还未达到平衡就向前移动，物质的非平衡运动，使区带展宽， H加大，颗粒小，固定相层薄，有利于增加柱效，而流速加大是不利的，图(5一2)是理论塔板高度与流动相流速的关系图。在气相色谱中，气体分子扩散快，流速影响特别大，H 随流速增加而急速下降，达到最低值，为实用最佳流速流速再加大时，传质影起了主要作用，H又加大，在液相色谱中分子扩散比在气相中低10一10倍，流速低时H不会有很大变化，流速快时对H也影响不大。在图5一2中，应尽可能使b线的斜率较小，才可不致因流速的提高而使塔板数下降。 (四)分离度相邻两个蜂的分离程度称为分离度R。两个蜂尖之间距离越大，分离度越大：两峰越宽则分高度越低。分离度R按下式计算： R (5-10 按式(5一10)很容易比较两化合物分离的好坏，但此式不能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离，要求用一些与实验技术有关的参数来表示分离度。假定相邻两峰的峰宽相等可导出分离度与上述三个基本色谱参数的关系 (5-11) 4 3 公式中(1)项中a是选择性或分离因子，与两组分的峰与峰之间的分离有关。如a=l, 无论柱的理论塔板数有多大，分离度R等于0。因此要获得分离，分配系数必须有差别，所以增加a,可使一个增带的中心相对于另一谱带发生位移。a是通过变更流动相和固定相组成来改变，固定相不易改变，所以a主要随流动相组成而变化。当然也可以通过衍生化等变待测组分的性质。公式中(2)项小K'是容量因子，可通过改变溶剂强度米改变。强溶剂出峰时间短，导致小的K'值，弱溶剂给出较大的K'值，分离度高，但峰变宽：公式中(3)项中N是理论塔板数，可由改变色谱柱的长度，颗粒的大小，增减流动相的

H＝A＋Cu （5—9） A 为涡流扩散项，它表示柱内填充剂的均匀性，颗粒直径和流动相流速等对样品分子所引起的涡流扩散影响，颗粒小而均匀，或组分在流动相中扩散系数大，则涡流扩散小，H 亦小，分离效能高，Cu 为传质速率项，组分在流动相和固定相中迅速达到平衡，才能形成较窄的谱带，如流动相流速快，组分还未达到平衡就向前移动，物质的非平衡运动，使区带展宽， H 加大，颗粒小，固定相层薄，有利于增加柱效，而流速加大是不利的，图（5－2）是理论塔板高度与流动相流速的关系图。在气相色谱中，气体分子扩散快，流速影响特别大，H 随流速增加而急速下降，达到最低值，为实用最佳流速，当流速再加大时，传质影响起了主要作用，H 又加大，在液相色谱中分子扩散比在气相中低 l04－105 倍，流速低时 H 不会有很大变化，流速快时对 H 也影响不大。在图 5—2 中，应尽可能使 b 线的斜率较小，才可不致因流速的提高而使塔板数下降。 (四)分离度相邻两个峰的分离程度称为分离度 R。两个峰尖之间距离越大，分离度越大；两峰越宽则分高度越低。分离度 R 按下式计算； 2 1 1 2 1 ( )( ) 2 t t R w w －＝＋（5－10）按式(5—10)很容易比较两化合物分离的好坏，但此式不能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离，要求用一些与实验技术有关的参数来表示分离度。假定相邻两峰的峰宽相等可导出分离度与上述三个基本色谱参数的关系 (3) (1) (2) 1 1 ' ( )( ) 4 ' 1 a K R N a K －＝＋（5－11）公式中(1)项中 a 是选择性或分离因子，与两组分的峰与峰之间的分离有关。如 a＝l，无论柱的理论塔板数有多大，分离度 R 等于 0。因此要获得分离，分配系数必须有差别，所以增加 a，可使一个谱带的中心相对于另一谱带发生位移。a 是通过变更流动相和固定相组成来改变，固定相不易改变，所以 a 主要随流动相组成而变化。当然也可以通过衍生化等改变待测组分的性质。公式中(2)项小 K’是容量因子，可通过改变溶剂强度来改变。强溶剂出峰时间短，导致小的 K’值，弱溶剂给出较大的 K’值，分离度高，但峰变宽；公式中(3)项中 N 是理论塔板数，可由改变色谱柱的长度，颗粒的大小，增减流动相的

速度而变动。柱长和保留时间是正比的，柱长加倍，分离所需的时间亦加倍。最好是通过提高柱填充剂的效能来达到，近年来高效液相色谱发展快，主要是在高效能填充剂方面有很大进图5一3表示不同因子对色谱的影响。图中(a)分离不良，两峰距离太近：(b)加大值后，提高了选择性，两峰分开：(c)在a的基础上，加大N提高柱效，使峰变窄，峰尖位置不变，但两峰可以分离：《小增大K”值，分离度好，但保留时间征长，峰拖尾后普带密。因此利用式(5一11)使给定的分离最佳化时，首先调整K·值，使K在2一5之间.诺带不太宽分离的时间亦合适，其次是选择N,以提高柱效如分离仍有问题，则可改变使其具有更大的选择性。 (a) () (e3 ta) 图5-3色语分离最佳化条件 () 一分离不直；《b)知大，提高选择性；（©）加大N,垫高柱袋；(@)增大K,改春分离三、装置高效液相色进仪的设计与所采用的分离原理无关，可以购买完整的仪器，亦可以购买单独的部件组装成适用的仪器，典型的液相色谱仪由以下部件组成，贮液器、梯度装置、输液泵、进样器、色谱柱、检测器，温控部件和记录仪等，其流程图，见图5一4。贮液8 进在■ 担温箝梯皮较置收集器图5-4高效液相色谱仪流程图 (一)贮存容器某些商品贮液器配备有流动相脱气的装置，装有加热器，温度调节器和磁力搅拌器，流动相的脱气是非常重要的，因为溶剂中溶解的空气在低压部件如检测器里会逸出气泡来，气泡的出现会使检测器的噪声加大。常用的除气方法有三形 1)加热 :2)抽真空法：3)超声波处理，有时为防止某种溶剂被氧化，可在贮液容器中充满氮气或氨气。在气相色谱中，用高压气瓶来提供一定压力和流速的气体：波相色谱是用泵来完成。流

动相输送、选择泵系统时应满足以下要求：1)输液压力高，早期液相色谱的进柱压为60 70kg/©m，现在液相色谱采用高速高效分离所需的小颗粒和小直径的色谱校，则要求进柱压大到300 500kg/cm2.2)要求高压下通过性子的液流是连续而无脉动，流动相的流面的变动不应超过2%，输送的流量范围：分析型为0一10ml/min,制备型为50一100ml mi。3)能耐流动相的腐蚀。4)泵的密封性要好，死体积小，以便于迅速更换溶剂和梯度洗脱。能满足上述要求的有机械恒流泵和气体恒压泵，液相色谱中最常用的是机械往复泵。恒定的无脉冲的高压泵能保证流量恒定和准确，获得稳定的基线和保留值重现性好，沃特斯 1erS)使用的是双泵头往复式柱塞泵，输出流精度士0.1%，流量的准确度为士1%，最高压力6000psi(相当于420kg/cm2),流速调节范围为0.1一9.9ml/mim,适于高精度的液谱分析工作，该泵配有压力传感器，可从压力表显示压力，并有压力安全选择器，设定压力极限值，压力超过时报警并自动停泵。二递度洗时气相色谱分析是为了改善分离和缩短分析周期采用程序升温控制：而在液相色增中使用梯度洗脱。所谓梯度洗脱足在个色谱分析周期里不断改变流动相的化学组分，使一些复杂混合物的分析能做到：1)提高分辨能力：2)峰形得到改善：3)缩短分析周期。梯度洗脱可分为低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。低压梯度是在常压下将不同极性的溶剂按预先设定的比例在泵前混合，再由高压泵输入色谱桂，高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，经充分混合后输入色谱柱。梯度洗服装置的溶剂混合器应具有体积小无死区清洗方便和混才能获得重复的梯度曲经梯度洗脱后的色增柱必须回复到起始的溶剂条件，然后再进行下一次分析，如果梯度变什在10%一15%以内，直接泵入起始浓度的移动相即可。如梯度变化很大，则逐步改变溶剂组分，不可在100%甲醇的柱子中直接泵入20%甲醉/水，压力和流速的突然变化可引起什床的损坏。在流动相为有机溶剂/水/盐类的体系中，必须保证盐类在整个梯度程序中完全容解，如使用0.005mol/L庚磺酸钠，它可完全溶甲醇：水=2：8中，但不能溶于甲醇水=8：2中，一旦盐类发生了不溶的沉淀，会损坏色谱柱，而且不能再生 (四)进样系统把样品引进色谱锭有两个基本方法，即注射器法和进样阀法。进样过程往往会影响分离效果，当注入样品后，由扩散而导致峰形展宽：而在高压状态下讲杆，难度较大：还要求讲样时不影响输液系统的压力和流速，也不出现漏液等现象。目前高效液相色谱仪多采用定显进样阀法阀内装有环形定量管，样品溶液在常压下靠注射器注入贮样管并把管中的溶剂顶出，再靠转动阀门，在保持高压不停流状态下将样品送入流路系统，其优点是进样时不受色谱系统压力的限制，可在常压下进样，进样量由定量进样阀调整，进样时不会发生漏液或堵塞进样口的现象，结果重现性好，话于按装自动进样器，由微处理机控制程序，可连续自动讲几十个样品 (五)色谱柱色谱柱是高效液谱仪的心脏部分。柱内填充填料的种类不同，性能也不同，通常采用不锈钢直形住，内径为2一4mm,长度为15一30cm,柱子加长能改善分离，但要提高柱入口处的压力，且加长分析时间。近年米高效填充剂的出现，实现了分离的高速和高效，经典的液相色谱填充剂：1)颗粒大，直径一般在100m以上：2)粒度不均匀，3)设有一定形状：4 经不住高压。高效液柏色谱填充剂：1)颗粒小，直径为10一30m,最小为3 :2)粒度均匀：3)一般为球形：4)能在高压下工作。近年来采用直径3一5m的填抖制成 -5cr 长的高效短柱，适于快速分析。此外，有用弹性聚四氟乙烯材料制成的径向加压柱，靠径向加压器使填料呈均匀规则排列可改善柱效，保留值的重现性好，在一般常规分析中亦可应用。样品中如有吸附性的组分，会影响色谱柱的使用寿命，除了应在进色谱柱前抽提或过迪

动相输送、选择泵系统时应满足以下要求：1)输液压力高，早期液相色谱的进柱压为 60 一 70 kg／cm2，现在液相色谱采用高速高效分离所需的小颗粒和小直径的色谱校，则要求进柱压大到 300 一 500 kg／cm2。2)要求高压下通过性子的液流是连续而无脉动，流动相的流量的变动不应超过 2％，输送的流量范围：分析型为 0－10 ml／min，制备型为 50—100ml／ min。3)能耐流动相的腐蚀。4)泵的密封性要好，死体积小，以便于迅速更换溶剂和梯度洗脱。能满足上述要求的有机械恒流泵和气体恒压泵，液相色谱中最常用的是机械往复泵。恒定的无脉冲的高压泵能保证流量恒定和准确，获得稳定的基线和保留值重现性好，沃特斯 (Waters)使用的是双泵头往复式柱塞泵，输出流量精度±0.1％，流量的准确度为±1％，最高压力 6000psi(相当于 420kg／cm2)，流速调节范围为 0.1—9.9ml／min，适于高精度的液谱分析工作，该泵配有压力传感器，可从压力表显示压力，并有压力安全选择器，设定压力极限值，压力超过时报警并自动停泵。 (三)梯度洗脱气相色谱分析是为了改善分离和缩短分析周期，采用程序升温控制；而在液相色谱中，使用梯度洗脱。所谓梯度洗脱足在一个色谱分析周期里不断改变流动相的化学组分，使一些复杂混合物的分析能做到：1)提高分辨能力；2)峰形得到改善；3)缩短分析周期。梯度洗脱可分为低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。低压梯度是在常压下将不同极性的溶剂按预先设定的比例在泵前混合，再由高压泵输入色谱桂，高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，经充分混合后输入色谱柱。梯度洗服装置的溶剂混合器应具有体积小，无死区、清洗方便和混合效率性能，才能获得重复的梯度曲线。经梯度洗脱后的色谱柱必须回复到起始的溶剂条件，然后再进行下一次分析，如果梯度变化在 10％一 15％以内，直接泵入起始浓度的移动相即可。如梯度变化很大，则逐步改变溶剂组分，不可在 l00％甲醇的柱子中直接泵入 20％甲醉／水，压力和流速的突然变化可引起什床的损坏。在流动相为有机溶剂／水／盐类的体系中，必须保证盐类在整个梯度程序中完全溶解，如使用 0.005mol／L 庚磺酸钠，它可完全溶于甲醇∶水＝2∶8 中，但不能溶于甲醇∶ 水＝8∶2 中，一旦盐类发生了不溶的沉淀，会损坏色谱柱，而且不能再生。（四）进样系统把样品引进色谱锭有两个基本方法，即注射器法和进样阀法。进样过程往往会影响分离效果，当注入样品后，由扩散而导致峰形展宽；而在高压状态下进杆，难度较大；还要求进样时不影响输液系统的压力和流速，也不出现漏液等现象。目前高效液相色谱仪多采用定量进样阀法，阀内装有环形定量管，样品溶液在常压下靠注射器注入贮样管，并把管中的溶剂顶出，再靠转动阀门，在保持高压不停流状态下将样品送入流路系统，其优点是进样时不受色谱系统压力的限制，可在常压下进样，进样量由定量进样阀调整，进样时不会发生漏液或堵塞进样口的现象，结果重现性好，适于按装自动进样器，由微处理机控制程序，可连续自动进几十个样品。 (五)色谱柱色谱柱是高效液谱仪的心脏部分。柱内填充填料的种类不同，性能也不同，通常采用不锈钢直形住，内径为 2—4mm，长度为 15—30 cm，柱子加长能改善分离，但要提高柱入口处的压力，且加长分析时间。近年来高效填充剂的出现，实现了分离的高速和高效，经典的液相色谱填充剂：1)颗粒大，直径一般在 l00 µm 以上；2)粒度不均匀，3)没有一定形状；4) 经不住高压。高效液柏色谱填充剂：1)颗粒小，直径为 10 一 30 µm，最小为 3—5µm；2)粒度均匀；3)一般为球形；4)能在高压下工作。近年来采用直径 3—5µm 的填抖制成 3—5cm 长的高效短柱，适于快速分析。此外，有用弹性聚四氟乙烯材料制成的径向加压柱，靠径向加压器使填料呈均匀规则排列可改善柱效，保留值的重现性好，在一般常规分析中亦可应用。样品中如有吸附性的组分，会影响色谱柱的使用寿命，除了应在进色谱柱前抽提或过滤

外，最简单的办法是在分析柱前连接一根3一5cm长的保护柱，内装与色谱柱性能相同的填料，使用0.2μm的过滤片，放在进样器和分析柱之间。保护柱可防止来自流动相和样品中的不溶性微粒对色 ,还可避免硅胶或键合相的流可可地 ,保护柱并不能无限止地吸附杂质，使用时应观察检测器讯号，如有基线漂移、怪峰或反压增加等现象，说明保护柱已被污染，应更换填料。色谱柱的填充方法：通常有干法和匀浆法两种，填装方法取决于填料微粒的大小，直径大于20m,可用干法填充：与填充气相色谱柱的方法相似。直径10m或5m的微粒，不能用干法装柱，采用匀浆方法将它们填充色谱柱中，通常有等比重匀浆法是选择与硅胶比重相似的溶剂如四溴乙烷等配成浆状液：由于该溶剂毒性力 ,硅胶对溴有吸附作用，不常用，改用二氧六烷和四氯化碳等，国内亦常用等比重匀浆法，其步嫌如下： (1)根据柱体积称取所需之载体于三角瓶中，每g裁体加3ml二氧六环和6ml四氯化碳匀浆液。 (2)将三角瓶置于超声波清洗器中10mi 至匀浆液呈半透明状无明显结块为止 (③)将匀浆液倒入匀浆罐中，化学键合相可在匀浆上部加些水，旋紧顶盖，打开高压放空阀。 (4)硅胶柱用脱水的己烷做顶替液，正相键合相用己烷做顶替液，反相键合相或离子交换剂可用甲醇或丙酮做项替液。 (⑤开动泵，打开放空阀：待顶替液从放空阀出口流出即关闭阀，压力保持在300一400 200kg/cm2时，说明匀浆液己被顶替液置换、柱子转在该压力下保持一段时间 (6)将泵流量调至最小，停泵，卸下柱子即可。 (六)检检测器是用于连续检测柱流出物中不同组分及其含量的部件：在农药分析中用得最多的是紫外检测器，相当于把紫外分光光度计连接到色谱柱后。对于在特定波长下有较大吸收峰的样品有很高的灵敏度它不易受温度和流速波动的影 ,有低噪声的特性 ,早期使用波长紫外检测器的工作波长为254m,以低压汞灯为光源，结构荷单、稳定性好，但对在 254m附近没有吸收的化合物不敏感，适用范围小。现在使用可调波长的紫外可见分光检测器，工作波长可在190一700m范围内任选，应用范用大大增加，以氘灯和钨灯为光源关外分光光度法原理及常用溶剂的紫外吸收请参阅本书第六章。此外还有差示折光检测器，是测量样品和流相系统总的折光指数。为了得到的响应，采用差分技术补偿波相的折光指数，任何物质只要其折光指数与洗脱液有足够的差别，就可以检测，所以适用范围广，但灵敏度低，选择性差，受温度干扰较大在农药分析中不常用。判定检测器性能的指标有以下几个：即灵敏度、噪声和漂移、检测限、线性范围等。① 灵敏度是以组分响应曲线的斜率来表示，即通过检测器的农药数量变化时，相应的响应值变化率，不同农药的响应曲线斜率是不同的，斜率愈大，表示灵敏度愈高。②噪声是指与农药无关的输出信号的变化，除了由于仪器的电子系统、电源电压或温度的波动外洗脱液的泡和污染可能是出现噪声的主要原因。③漂移是基线随时间增加而产生的定向缓慢变化，噪声和漂移都直接影响检测能力和分析工作的误差。④色谱峰高度为最大噪声的2倍时，为最小检测限。⑥线性范围是检测器输出信号与被测组分量呈线性关系的范围。 (七控温系统早期液相色谱大多采用常温操作现在随着色谱技术的进展，逐渐重视升温技术般说米，温度低一些，能提高分离度，但高温可以加快分析速度，因此要综合考虑以上两个因素，在液固吸附色谱和液液分配色谱中，温度恒定是极为重要的，因为温度的改变，会产生不均匀吸附和不均匀分配，故液相色谱中不采用程序升温分析，色谱填料往往随温度升降

外，最简单的办法是在分析柱前连接—根 3—5cm 长的保护柱，内装与色谱柱性能相同的填料，使用 0.2µm 的过滤片，放在进样器和分析柱之间。保护柱可防止来自流动相和样品中的不溶性微粒对色谱挂的堵塞，还可避免硅胶或键合相的流失，可维护柱效，保护柱并不能无限止地吸附杂质，使用时应观察检测器讯号，如有基线漂移、怪峰或反压增加等现象，说明保护柱已被污染，应更换填料。色谱柱的填充方法：通常有干法和匀浆法两种，填装方法取决于填料微粒的大小，直径大于 20 µm，可用干法填充；与填充气相色谱柱的方法相似。直径 l0 µm 或 5µm 的微粒，不能用干法装柱，采用匀浆方法将它们填充到色谱柱中，通常有等比重匀浆法，是选择与硅胶比重相似的溶剂如四溴乙烷等配成浆状液；由于该溶剂毒性大，硅胶对溴有吸附作用，已不常用，改用二氧六烷和四氯化碳等，国内亦常用等比重匀浆法，其步骤如下： (1)根据柱体积称取所需之载体于三角瓶中，每 g 裁体加 3ml 二氧六环和 6m1 四氯化碳匀浆液。 (2)将三角瓶置于超声波清洗器中 10 min，至匀浆液呈半透明状无明显结块为止。 (3)将匀浆液倒入匀浆罐中，化学键合相可在匀浆上部加一些水，旋紧顶盖，打开高压放空阀。 (4)硅胶柱用脱水的己烷做顶替液，正相键合相用己烷做顶替液，反相键合相或离子交换剂可用甲醇或丙酮做顶替液。 (5)开动泵，打开放空阀；待顶替液从放空阀出口流出即关闭阀，压力保持在 300 一 400 kg／cm2，当压力下降到 100 一 200 kg／cm2 时，说明匀浆液已被顶替液置换，柱子装填完毕，在该压力下保持一段时间。 (6)将泵流量调至最小，停泵，卸下柱子即可。 (六)检测器检测器是用于连续检测柱流出物中不同组分及其含量的部件；在农药分析中用得最多的是紫外检测器，相当于把紫外分光光度计连接到色谱柱后。对于在特定波长下有较大吸收峰的样品，有很高的灵敏度。它不易受温度和流速波动的影响，有低噪声的特性，早期使用单波长紫外检测器的工作波长为 254nm，以低压汞灯为光源，结构简单、稳定性好，但对在 254nm 附近没有吸收的化合物不敏感，适用范围小。现在使用可调波长的紫外可见分光检测器，工作波长可在 190 一 700 nm 范围内任选，应用范围大大增加，以氘灯和钨灯为光源，有关紫外分光光度法原理及常用溶剂的紫外吸收请参阅本书第六章。此外还有差示折光检测器，是测量样品和流动相系统总的折光指数。为了得到足够的响应，采用差分技术补偿波动相的折光指数，任何物质只要其折光指数与洗脱液有足够的差别，就可以检测，所以适用范围广，但灵敏度低，选择性差，受温度干扰较大在农药分析中不常用。判定检测器性能的指标有以下几个：即灵敏度、噪声和漂移、检测限、线性范围等。① 灵敏度是以组分响应曲线的斜率来表示，即通过检测器的农药数量变化时，相应的响应值变化率，不同农药的响应曲线斜率是不同的，斜率愈大，表示灵敏度愈高。②噪声是指与农药无关的输出信号的变化，除了由于仪器的电子系统、电源电压或温度的波动外，洗脱液的气泡和污染可能是出现噪声的主要原因。③漂移是基线随时间增加而产生的定向缓慢变化，噪声和漂移都直接影响检测能力和分析工作的误差。④色谱峰高度为最大噪声的 2 倍时，为最小检测限。⑥线性范围是检测器输出信号与被测组分量呈线性关系的范围。 (七)控温系统早期液相色谱大多采用常温操作，现在随着色谱技术的进展，逐渐重视升温技术。一般说来，温度低一些，能提高分离度，但高温可以加快分析速度，因此要综合考虑以上两个因素，在液固吸附色谱和液液分配色谱中，温度恒定是极为重要的，因为温度的改变，会产生不均匀吸附和不均匀分配，故液相色谱中不采用程序升温分析，色谱填料往往随温度升降

产生膨胀和收缩，在某些情况下，温度突然变化会损坏柱床，使用时温度应逐渐升高，实验结束后，应将柱子慢慢降到室温再停系。四、分类根据固定相对样品分子的保留机理不同主要分为以下4种类型。 1.液固吸附色谱是用高比表面积的颗粒作固定相，根据物质对吸附剂活性表面的吸其固定相是由在组成上与流动相互不相溶的另种液体或是借化学键合到颗粒或载体上，物质的分离是由于不同溶质在两个液相中分配系数不同而达到的。 3.离子交换色谱固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，是根据移动相中样本的不同离子对固定相固定电荷部位的亲和力大小不同而进行分离， 4。凝胶色谱或空间排阻色谱周定相为不同孔径的多孔凝胶，是根据多孔凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离。排阻是指大分子不能进入小的凝胶孔中而披排阻在凝胶颗粒之外，而小分子可进入凝胶内部，在分离过程中，大分子随流动相 “起移动得较小子进入凝胶内部移动较慢，这样大小分子可以分开，其分离是严格按照分子尺寸进行的，适用于非离子型的、分子量高的化合物的分离或分子大小差别很大的样本分离，在农药常量分析中很少应用。本章将者重讨论前三类液相色谱方法，上述分离机理，除用于分离分析色谱，还可用于制备色谱法，制各色谱是制备色谱纯物的技术用以分离：收集多种色谱纯组供定性鉴定或作色谱标样，它与分离分析色谱的主要区别是色谱柱尺寸大，柱容量高，可分离的样品量高几个数量级。制备色谱有两种类型，一类是专用制备色谱仪，色谱系统和技术与常规色谱有较大差异，制备样品量为0.1一1000g:另一类是在分析色谱仪上进行，色语柱按比例放大，色谱条件与分析分离大致相同，制备量为0.1一25mg )液固吸附色谱法液固吸附色谱是液相色谱中研究和应用得最早的一种，以具有高比表面积的颗粒作为固定相。根据样本中各组分对固定相表面吸附作用的差异进行分离和分析的方法，适用于分离溶于有机溶剂、具有中等分子量、非离子型的化合物，对于具有不同官能团或不同数目的官能团的组分分子，具右很好的选轻性，还特别话用于异构体的分离在装填有吸附剂的层析柱内当流动相流过吸附剂时，吸附剂表面被溶剂分子S)以单分子层形式完全占有当样本分子X)(或溶质分子)被流动相带人柱内，在移动的过程中便扩散到吸附剂表面和微孔内，并在所有表面上与已结合的溶剂分子($)进行竞争吸附，见图5一5。 X十S时X限用十S (5-12》虎动根固定相溶质分子图5-5液固吸附色谱模型如果试样分子(X)对吸附剂表面吸附基团的（如硅胶的硅羟基）吸引力（包括色散力、诱导力，氢键等)大于溶剂分子(S),溶剂分子被排斥，试样分子被吸附，则X取代S而吸附在吸

产生膨胀和收缩，在某些情况下，温度突然变化会损坏柱床，使用时温度应逐渐升高，实验结束后，应将柱子慢慢降到室温再停泵。四、分类根据固定相对样品分子的保留机理不同主要分为以下 4 种类型。 1．液固吸附色谱是用高比表面积的颗粒作固定相，根据物质对吸附剂活性表面的吸附能力的差异而进行分离。 2．液液分配色谱其固定相是由在组成上与流动相互不相溶的另一种液体或是借化学键合到颗粒或载体上，物质的分离是由于不同溶质在两个液相中分配系数不同而达到的。 3．离子交换色谱固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，是根据移动相中样本的不同离子对固定相固定电荷部位的亲和力大小不同而进行分离， 4．凝胶色谱或空间排阻色谱固定相为不同孔径的多孔凝胶，是根据多孔凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离。排阻是指大分子不能进入小的凝胶孔中而披排阻在凝胶颗粒之外，而小分子可进入凝胶内部，在分离过程中，大分子随流动相一起移动得较快，小分子进入凝胶内部移动较慢，这样大小分子可以分开，其分离是严格按照分子尺寸进行的，适用于非离子型的、分子量高的化合物的分离或分子大小差别很大的样本分离，在农药常量分析中很少应用。本章将着重讨论前三类液相色谱方法，上述分离机理，除用于分离分析色谱，还可用于制备色谱法，制备色谱是制备色谱纯物质的技术。用以分离、收集一种或多种色谱纯组分，供定性鉴定或作色谱标样，它与分离分析色谱的主要区别是色谱柱尺寸大，柱容量高，可分离的样品量高几个数量级。制备色谱有两种类型，一类是专用制备色谱仪，色谱系统和技术与常规色谱有较大差异，制备样品量为 0.1—1000 g；另一类是在分析色谱仪上进行，色谱柱按比例放大，色谱条件与分析分离大致相同，制备量为 0.1—25mg。 (一)液固吸附色谱法液固吸附色谱是液相色谱中研究和应用得最早的一种，以具有高比表面积的颗粒作为固定相。根据样本中各组分对固定相表面吸附作用的差异进行分离和分析的方法，适用于分离溶于有机溶剂、具有中等分子量、非离子型的化合物，对于具有不同官能团或不同数目的官能团的组分分子，具有很好的选择性，还特别适用于异构体的分离。在装填有吸附剂的层析柱内，当流动相流过吸附剂时，吸附剂表面被溶剂分子(S)以单分子层形式完全占有，当样本分子(X)(或溶质分子)被流动相带人柱内，在移动的过程中便扩散到吸附剂表面和微孔内，并在所有表面上与已结合的溶剂分子（S）进行竞争吸附，见图 5－5。 X S X S ＋吸附吸附＋（5－12）如果试样分子(X)对吸附剂表面吸附基团的(如硅胶的硅羟基)吸引力(包括色散力、诱导力，氢键等)大于溶剂分子(S)，溶剂分子被排斥，试样分子被吸附，则 X 取代 S 而吸附在吸

附剂表面，称为竞争吸附现象。在一定的浓度范围内，这一吸附一一脱吸附过程是热力学平衡过程（线性等温吸附），这种竞争吸附达到平衡后，可用下式来表示： (5-13) (X)(S级附】式中K为分配系数。由此式可看出，如果溶剂分子吸附性强，则被吸附的试样分子(X) 相应减少。但是在流动相中流动相（溶剂）分子与样品分子之间亦存在相互作用，这种附加的作用增加了色谱过程的复杂性，试样分子在吸附剂表面和在滴相中的存在也达到了动态平衡，因此试样谱柱内的保留行为与吸附剂和流动相有关，适当地选择与此二项有关的数，可以使试样在柱内获得良好的分离和保留。 1.吸附色谱固定相的类别常用的吸附剂主要有硅胶和氧化铝等，氧化铝有时会发生催化反应，己很少使用。硅胶吸附剂用得最多。其特点为：①化学性质稳定，不会与试剂发生反应：②机械性能强，不会溶涨：@由于多孔结构而具有高的线性容量：①在制造过程中可以控制其物理性能如比表面、孔结构等：吸附色谱主要是利用物质在吸附剂和流动相中的可逆平衡，以及吸附剂对不同物质吸附力的差异而使物质分离的，因此吸附剂和流动相的选择是吸附色谱成败的关键。同一种吸附剂如制备方法、处理方法不同，吸附能力也会相应改变，分离情况也不同。改进色谱柱填料的结构、性能和填充均匀性，可使液相色普状到高速和高效。经典液相色谱使用全多引大颗粒图5一6，（©，粒度范围广，形状不规则，柱内填充床很难达到均匀和紧密，不均匀铺层所产生的涡流会引起色增区带明显扩散，此外，这些多孔型吸附剂的深孔显著地廷缓了试样分子的传质过程，也引起了色谱区带的扩散。 1-24m 探孔 t6, te) O夫表陆收影纯的先图全事玩室大聚驰为了克服以上缺点，高效液相色谱主要采用以下两种结构型的吸附剂填料图56)。 (1)海壳型硅胶：是在平均粒径为35μm玻璃微球表面上涂覆1一2μm厚的蒲层硅胶，这就提高了承受高压的机械强度和填充的均匀性：有些薄壳型填料还采用大的孔径，可显著减低分子在吸附剂深孔中缓慢传质过程所造成的色谱区带扩散，这类填抖称表面多孔珠，多孔层珠或薄壳珠，薄壳型硅胶的传质过程快，有利于快速分析。其缺点是比表面积小，样本负荷量小，柱效不够高，它的应用已逐渐减少。 (②)全多孔微粒型硅胶：粒径减小，填料微孔的相对深度也减小，可以加快传质速率，因此高效液相色谱大多采用全多孔微粒型吸附剂，常用5um和10um二种，筛分范围一般为士2um左右，最高校效可达800-1000板/m, 它的优点是柱效高，分离能力强，可使用较短的柱上样量大 ,可降低最小检测量 2.吸附色谱固定相的性质在液固吸附色谱中控制保留值和选择性的重要因素是吸附剂的比表面积和表面活性。 (1)比表面积S:吸附作用是发生在相界面上，被吸附物质的量随着吸附表面增大而增加

附剂表面，称为竞争吸附现象。在一定的浓度范围内，这一吸附——脱吸附过程是热力学平衡过程(线性等温吸附)，这种竞争吸附达到平衡后，可用下式来表示： ( )( ) ( )( ) X S K X S 吸附吸附＝（5－13）式中 K 为分配系数。由此式可看出，如果溶剂分子吸附性强，则被吸附的试样分子(X) 相应减少。但是在流动相中流动相(溶剂)分子与样品分子之间亦存在相互作用，这种附加的作用增加了色谱过程的复杂性，试样分子在吸附剂表面和在流动相中的存在也达到了动态平衡，因此试样在色谱柱内的保留行为与吸附剂和流动相有关，适当地选择与此二项有关的参数，可以使试样在柱内获得良好的分离和保留。 1．吸附色谱固定相的类别常用的吸附剂主要有硅胶和氧化铝等，氧化铝有时会发生催化反应，已很少使用。硅胶吸附剂用得最多。其特点为：①化学性质稳定，不会与试剂发生反应；②机械性能强，不会溶涨；＠由于多孔结构而具有高的线性容量；①在制造过程中可以控制其物理性能，如比表面、孔结构等。吸附色谱主要是利用物质在吸附剂和流动相中的可逆平衡，以及吸附剂对不同物质吸附力的差异而使物质分离的，因此吸附剂和流动相的选择是吸附色谱成败的关键。同一种吸附剂如制备方法、处理方法不同，吸附能力也会相应改变，分离情况也不同。改进色谱柱填料的结构、性能和填充均匀性．可使液相色谱达到高速和高效。经典液相色谱使用全多孔大颗粒图 5—6，(c)，粒度范围广，形状不规则，柱内填充床很难达到均匀和紧密，不均匀铺层所产生的涡流会引起色谱区带明显扩散，此外，这些多孔型吸附剂的深孔显著地廷缓了试样分子的传质过程，也引起了色谱区带的扩散。为了克服以上缺点，高效液相色谱主要采用以下两种结构型的吸附剂填料(图 5—6)。 (1)薄壳型硅胶：是在平均粒径为 35µm 玻璃微球表面上涂覆 l—2µm 厚的蒲层硅胶，这就提高了承受高压的机械强度和填充的均匀性；有些薄壳型填料还采用大的孔径，可显著减低分子在吸附剂深孔中缓慢传质过程所造成的色谱区带扩散，这类填抖称表面多孔珠，多孔层珠或薄壳珠，薄壳型硅胶的传质过程快，有利于快速分析。其缺点是比表面积小，样本负荷量小，柱效不够高，它的应用已逐渐减少。 (2)全多孔微粒型硅胶：粒径减小，填料微孔的相对深度也减小，可以加快传质速率，因此高效液相色谱大多采用全多孔微粒型吸附剂，常用 5µm 和 10 µm 二种，筛分范围一般为±2µm 左右，最高校效可达 80000 一 100000 板／m，它的优点是柱效高，分离能力强，可使用较短的柱子，上样量大，可降低最小检测量。 2．吸附色谱固定相的性质在液固吸附色谱中控制保留值和选择性的重要因素是吸附剂的比表面积和表面活性。 (1)比表面积 S：吸附作用是发生在相界面上，被吸附物质的量随着吸附表面增大而增加

华南农业大学：《农药残留分析》课程教学资源（教案讲义）第五章 高效液相色谱法

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