第五章高效液相色谱法 概论 ,二、基本原理 ,三、装置 。四、分类 ~五、在农药分析中的应用
第五章 高效液相色谱法 ❖ 一、概论 ❖ 二、基本原理 ❖ 三、装置 ❖ 四、分 类 ❖ 五、在农药分析中的应用
一、 概论 以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相 色谱 经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内， 吸附剂粒径大于00um,柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高， 每粮柱只能使用次；，流动相由柱管上端依靠重力向下流过柱子，分离 速度慢；各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进行测定， 效率很低，分析速度很慢。 40年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快，但重复性 差， 难以进行定量测定。 60年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正后用于液相色 谱 为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效 定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自 动化；这种色谱技宋称为高效液相色谱法
一、概论 以液体作流动相，液体或固体作固定相的分离分析技术称为液相 色谱法。 经典的柱色谱法是用碳酸钙或氯化铝等吸附剂填充于玻璃柱管内， 吸附剂粒径大于l00µm，柱的装填不紧密，不均匀，分离效率不高， 每根柱只能使用1次；流动相由柱管上端依靠重力向下流过柱子，分离 速度慢；各组分依次被淋洗下来，收集分离后的组分，再进行测定， 效率很低，分析速度很慢。 40年代出现了薄层色谱法，操作方便，分析速度加快，但重复性 差，难以进行定量测定。 60年代初吉丁斯(J.C.Giddings)将气相色谱理论修正后用于液相色 谱，为其现代化奠定了理论基础。以后在技术上采用了高压泵、高效 固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自 动化；这种色谱技术称为高效液相色谱法
高效液相色谱法和经典柱色谱法相比，具有以下特 点： 1.高压流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地 通过色谱柱，必须施加高压。一般可达150一300kg/c2。 2. 高速使用无脉动的高压泵、，流动相的流速一船为1一10ml/min, 使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。 3.高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效 可达50000塔板/m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。 4. 高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外 检测器，最小检测量可达1×10—9g。 5. 高度自动化利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现 了高度自动化。 6.流出组分容易收集
高效液相色谱法和经典柱色谱法相比，具有以下特 点： 1．高压 流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地 通过色谱柱，必须施加高压。一般可达150一300 kg／cm2。 2．高速 使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为1—10 ml／min， 使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。 3．高效 使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效 可达50000塔板／m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。 4．高灵敏度 应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。使用紫外 检测器，最小检测量可达1×10—9g。 5．高度自动化 利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现 了高度自动化。 6．流出组分容易收集
高效液相色谱法和气相色谱法的差别 高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们在 许多方面是相同和相似点，但也存茬着差异。 (1)应用领域不同。，在已知的化合物中，只有20%可用气相色谱测定，而 液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80%一85%；气相色谱法局 限舌暴挥发和垫稳定姿藐的分离和分板：亮效液相色请可分离秘分折 不挥爱的、热稳是性差的以及离子型的农药，而直样本前处理简使。 (2)气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的 流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氨 气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对 谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择 因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。 而液相色谱的流动相为液体，它对样本真有二定溶解性能，除了运载 样本组分通过色谱往和进入检测器外，还参与色谱分离过程；在液相 色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来 分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全 不同的分离
高效液相色谱法和气相色谱法的差别 高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们在 许多方面是相同和相似点，但也存在着差异。 (1)应用领域不同。在已知的化合物中，只有20％可用气相色谱测定，而 液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80％一85％；气相色谱法局 限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；高效液相色谱可分离和分折 不挥发的、热稳定性差的以及离子型的农药，而且样本前处理简便。 (2)气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的 流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氦 气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对 色谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择 性，因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。 而液相色谱的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载 样本组分通过色谱住和进入检测器外，还参与色谱分离过程；在液相 色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来 改善分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全 不同的分离
(③)液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的 条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。 根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。 (4)农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小4一5个数量级，所以在 高效液相色谱中必须特别注意柱外效应对分离的不良彤响。 (⑤)液体的粘度比气体的粘度大2一3个数量级，所以液相色谱的柱长通 常不超过30cm,而气相色谱可采用长柱，填充柱的长度为0.5一3m, 空心柱柱长可达几十米。 (6)液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在气相色谱中与载气体 积有关的参数都必须进行校正
(3)液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的 条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。 根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。 (4)农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小4—5个数量级，所以在 高效液相色谱中必须特别注意柱外效应对分离的不良彤响。 (5)液体的粘度比气体的粘度大2—3个数量级，所以液相色谱的柱长通 常不超过30cm，而气相色谱可采用长柱，填充柱的长度为0.5—3m， 空心柱柱长可达几十米。 (6)液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在气相色谱中与载气体 积有关的参数都必须进行校正
二、基本原理 高效液相色谱的基本理论是在经典液相色谱的基础上，引入了气相 色谱的理论，加以改进而发展的。本节不再介绍与气相色谱有关的基本 理论。 使用液相色谱的最终日的是要求在最短时间内，使样本获得最好的 分离和分析，因此分离度是最主要的。 (一)选择性（分离因子） 色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。 它是两个组分净保留时间的比（即相对保留值）或两个组分的平衡分配之 比
二、基本原理 高效液相色谱的基本理论是在经典液相色谱的基础上，引入了气相 色谱的理论，加以改进而发展的。本节不再介绍与气相色谱有关的基本 理论。 使用液相色谱的最终目的是要求在最短时间内，使样本获得最好的 分离和分析，因此分离度是最主要的。 (一)选择性(分离因子) 色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。 它是两个组分净保留时间的比(即相对保留值)或两个组分的平衡分配之 比
(1z 3 4 B时(in】 困5-1高效液相色谱国 V—保留体积；t—保留时间；W一为峰宽；h—为峰高 根据图5一1的两个峰，选择性可用下式表示： a(选择性)=一= (5-1) t-to k t为溶剂保留时间，t1和t2为峰1和峰2的保留时间，式中k和k2是农药1和2的 分配系数。 分配系数K= 化合物在固定相中的浓度 化合物在移动相中的浓度 (5-2)
V——保留体积；t——保留时间；W——为峰宽；h——为峰高 根据图5－1的两个峰，选择性可用下式表示： （5－1） t0为溶剂保留时间，t1和t2为峰1和峰2的保留时间，式中k1和k2是农药1和2的 分配系数。 （5－2） 2 0 2 1 0 1 ( ) t t k t t k － 选择性 ＝ ＝ － K 化合物在固定相中的浓度 分配系数 ＝ 化合物在移动相中的浓度
(二) 容量因子 某一特定化合物在色谱柱上的容量因子是衡量该柱对此化合物的 保留特性，化合物的净保留时间与非滞留时间之比，根据图5一1，峰 1的容量因子为： K=二0 (5-3)
（二）容量因子 某一特定化合物在色谱柱上的容量因子是衡量该柱对此化合物的 保留特性，化合物的净保留时间与非滞留时间之比，根据图5—1，峰 1的容量因子为： 1 0 （5－3） 0 ' t t K t － ＝
(三)柱效 柱效是衡量某一特定色谱柱对化合物的谱带展宽度和改善分离的 能力，用理论塔板数来表示，根据图5一1，理论塔板数N)可用下式 表示： W=164)P (5-4) (w)2 根据式(5一4)，理论塔板数随t成正比地增大，洗脱的谱带宽度增 加，理论塔板数下降。因半峰宽易测量准确，计算的N值也比较准确， 可用W0.5来表示。 W=5.544)2 (5-5) (5)月 实际计算时，使用理论塔板的相当高度HETP(或H)较方便，它 也是柱效率的量度。 HETP- L W (5—6) L为柱的长度，H小则N大，即柱效高
(三)柱 效 柱效是衡量某一特定色谱柱对化合物的谱带展宽度和改善分离的 能力，用理论塔板数来表示，根据图5—1，理论塔板数(N)可用下式 表示： （5－4） 根据式(5—4)，理论塔板数随t成正比地增大，洗脱的谱带宽度增 加，理论塔板数下降。因半峰宽易测量准确，计算的N值也比较准确， 可用W0.5来表示。 （5－5） 实际计算时，使用理论塔板的相当高度HETP（或H）较方便，它 也是柱效率的量度。 （5－6） L为柱的长度，H小则N大，即柱效高。 2 1 2 1 ( ) 16 ( ) t N w ＝ 2 1 2 0.5 ( ) 5.54 ( ) t N w ＝ L HETP N ＝
(四)分离度 相邻两个峰的分离程度称为分离度R。两个峰尖之间距 离越大，分离度越大；两峰越宽则分离度越低。分离度R 按下式计算： R- 12二4 斯+g,) (5-7) 按式(5一7)很容易比较两化合物分离的好坏，但此式不 能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离
(四)分 离 度 相邻两个峰的分离程度称为分离度R。两个峰尖之间距 离越大，分离度越大；两峰越宽则分离度越低。分离度R 按下式计算： （5－7） 按式(5—7)很容易比较两化合物分离的好坏，但此式不 能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离。 2 1 1 2 1 ( )( ) 2 t t R w w － ＝ ＋