7期 孙蒙祥等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 表1融合程序中所用各种溶液成分表 Table I Com po on of solutons used at different stages of fusin procedure 成分 酶解液 中继液 Fusion soluton Fusion soluton 清洗液 果胶酶 0.5%-1% 红素 甘露醇 M anatol 0.1mo 蔗糖 0.35 mon 0.45 mol PE 0.01mo 0.01mo 0.04 mol 0.1 mg/mI 0.1 mg/m 三)观察与摄影 以FDA染色观察融合体活性以DAPI染色观察融合体细胞核。在 O lympus CK2倒 置显黴镜下操作,用 Olympus mt-2倒置显微镜摄影 结果 经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最 好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体,或用大小不等的原生质体为 材料,探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一)融合过程 用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版I,1),通过手工操作 使其相互接触与粘连(图版I,2),此时2个原生质体会发生猛然的相向压缩,继而每一原 生质体由原来的球形变成半球形状态,两者紧粘合(图版I,3)。这一过程一般在2分钟内 完成。显微观察显示如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩,则不能继续 进行融合,稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种 情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程,有必要将融合产物 转入含低浓度PEG的中继液中放置10分钟以上,以利融合的完成。在中继液中两原生质 体间尚可见一或深或浅的界线,再转入清洗液后,界线逐渐模糊甚至消失(图版Ⅰ,4、5) 经DAPI染色荧光镜检,内含2核,是为同核体(图版Ⅰ,6)。用微吸管将逐对融合的原生 质体加以富集,一起转移、清洗(图版Ⅰ,9、10),以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染 色反应显示,融合体都是生活的(图版I,11 二)操作方法 单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作 过程中不致从视野中消失,提高工作效率,可根据不同情况分别采取下列几种具体方法 1.当供试双方原生质体数量较多时,可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net表 1 融合程序中所用各种溶液成分表 T able l Composition of solutions used at different stages of fusion p rocedure 成分 Component 酶解液 Enzym e solution 融合液 Fusion solution (1) 中继液 Fusion solution (2) 清洗液 W ashing solution 果胶酶 Pectinase 015% —1% - - - 纤维素酶 Cellulase R210 1% —115% - - - 甘露醇 M annitol 0148 molöL 011 molöL - - 蔗 糖 Sucrose - - 0135 molöL 0145 molöL PEG (6000) - 25% 10% - CaCl2·2H2O - 0101 molöL 0101 molöL 0104 molöL KH2PO 4 011 m göm l 011 m göm l 011 m göm l - pH 516 516 516 7—9 (三) 观察与摄影 以 FDA 染色观察融合体活性; 以DA P I染色观察融合体细胞核。在O lympus CK2 倒 置显微镜下操作, 用O lympus IM T22 倒置显微镜摄影。 结 果 经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最 好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体, 或用大小不等的原生质体为 材料, 探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一) 融合过程 用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版É , 1) , 通过手工操作 使其相互接触与粘连(图版É , 2) , 此时 2 个原生质体会发生猛然的相向压缩, 继而每一原 生质体由原来的球形变成半球形状态, 两者紧粘合(图版É , 3)。这一过程一般在 2 分钟内 完成。显微观察显示: 如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩, 则不能继续 进行融合, 稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种 情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程, 有必要将融合产物 转入含低浓度 PEG 的中继液中放置 10 分钟以上, 以利融合的完成。在中继液中两原生质 体间尚可见一或深或浅的界线, 再转入清洗液后, 界线逐渐模糊甚至消失(图版É , 4、5)。 经DA P I染色荧光镜检, 内含 2 核, 是为同核体(图版É , 6)。用微吸管将逐对融合的原生 质体加以富集, 一起转移、清洗(图版É , 9、10) , 以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染 色反应显示, 融合体都是生活的(图版É , 11)。 (二) 操作方法 单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作 过程中不致从视野中消失, 提高工作效率, 可根据不同情况分别采取下列几种具体方法: 11 当供试双方原生质体数量较多时, 可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 7 期 孙蒙祥等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 194