《植物学报》：用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合（武汉大学：孙蒙祥、杨弘远、周嫦）.pdf_大学文库

0. 45 mol sucro se and 0.04 mol CaCb. 2HO(pH 7-9). Com pared w ith conventional fusin m ethods adop ted to pro top last populaton, the present m ethod can avo d either blind fusin of p rotop lasts bebnging to one partner and fuson among m ult p le p rotop lasts, or the presence of unfused protop lasts, thus en sure the fuson to be precisely at the level of a cted pair of single p top lasts more it is smp le and co potent ality for w ide app licaton in som atic hy brid on and particularly in the case of m all uantity of parental p top lasts such as in v itro in an etic fusion stud ies Key words Pro top last: Fusin Po lyethy lene glyco 通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建,是植物细胞工程的重要手段。现有的融合技术中,以聚乙二醇(PEG)诱导融合和电融合二者占主要地位。其中PEG融合技术具有设备简单、操作方便等优点,至今仍然广泛采用。但现行PEG融合技术是在原生质体群体的条件下进行的,因而在融合产物中除了所欲获得的杂种细胞外还不可避免地含有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质体的融合体,从而增加了融合后筛选的困难。此外,在有些情况下,可供融合的亲本原生质体数量很少,现行的PEG法亦难适用。Koop等创建的成对原生质体微电融合技术克服了上述缺点,使原生质体融合技术得以精确化,不仅成功地用于体细胞原生质体以、亚原生质体的融合及细胞包器的转移,而且还被 Kranz等采用,成功地进行了玉米精、卵的体外融合,并再生了植株。然而,这种微电融合技术需要特殊仪器,难以推广应用。如果能够使PEG融合技术提高到成对原生质体融合的水平,则将兼有简易与精确两方面优点。为此,我们做了以下实验,并获得肯定的结果。材料和方法实验材料为烟草 v icotiana tabacun l.)品种G-80 (一)原生质体分离选用大田种植的幼苗10-—20cm长的叶片或试管内种植的无菌苗1.2-2.5m长的叶片,撕去下表皮,将小块叶片置于酶解液中。在25℃下保温4-6小时,用200目不锈钢网过滤去残渣,离心去酶液。原生质体以0.45moM蔗糖溶液漂浮纯化并洗涤两次备用, 或转入0.48mo甘露醇中沉降与保存备用。 (二)原生质体融合采用以下两种方法:(1)将一滴融合液加在载玻片上。在倒置显微镜下以手工制备的微吸管(尖端口径约200μm),由亲本原生质体群体中各吸取1个原生质体,置于融合液小滴中。通过手工操作微吸管轻轻移动原生质体,使之接触与粘连。然后将已紧密粘连的对原生质体转入中继液中,静置片刻,再转入清洗液中除去残余的PEG。最后将其转入培养基中。(2)将约2m1融合液加入3am直径的培养皿中,在融合液上覆盖一薄层石蜡油用微吸管将选定的一对原生质体置入融合液中,按前述步骤进行融合。原生质体酶解、融合、中继和清洗4种溶液的成分见表1。 S1994-2008ChinaAcademicJourmalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

0145 molöL sucrose and 0104 molöL CaC l2·2H 2O ;pH 7—9Γ. Compared w ith conventional fusion m ethods adop ted to p rotop last populationΚ the p resent m ethod can avoid either blind fusion of p rotop lasts belonging to one partner and fusion among m ultip le p rotop lastsΚor the p resence of unfused p rotop lastsΚ thus ensure the fusion to be p recisely at the level of a selected pair of single p rotop lasts. M oreoverΚ it is simp le and convenient enough to show its potentiality for w ide app lication in som atic hybridization and particularly in the case of sm all quantity of parental p rotop lasts such as in v itro intergam etic f usion stud ies. Key words P rotop lastΜFusionΜPolyethylene glycol 通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建, 是植物细胞工程的重要手段。现有的融合技术中, 以聚乙二醇(PEG) 诱导融合和电融合二者占主要地位。其中 PEG 融合技术具有设备简单、操作方便等优点, 至今仍然广泛采用。但现行 PEG 融合技术是在原生质体群体的条件下进行的, 因而在融合产物中除了所欲获得的杂种细胞外, 还不可避免地含有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质体的融合体, 从而增加了融合后筛选的困难。此外, 在有些情况下, 可供融合的亲本原生质体数量很少, 现行的 PEG 法亦难适用。Koop 等创建的成对原生质体微电融合技术克服了上述缺点, 使原生质体融合技术得以精确化, 不仅成功地用于体细胞原生质体[ 1 ]、亚原生质体[ 2, 3 ]的融合及细胞包器的转移[ 4—6 ] , 而且还被 K ranz 等采用, 成功地进行了玉米精、卵的体外融合[ 7 ] , 并再生了植株[ 8 ]。然而, 这种微电融合技术需要特殊仪器, 难以推广应用。如果能够使 PEG 融合技术提高到成对原生质体融合的水平, 则将兼有简易与精确两方面的优点。为此, 我们做了以下实验, 并获得肯定的结果。材料和方法实验材料为烟草(N icotiana tabacum L. ) 品种 G280。 (一) 原生质体分离选用大田种植的幼苗 10—20 cm 长的叶片或试管内种植的无菌苗 112—215 cm 长的叶片, 撕去下表皮, 将小块叶片置于酶解液中。在 25℃下保温 4—6 小时 , 用 200 目不锈钢网过滤去残渣, 离心去酶液。原生质体以 0145 molöL 蔗糖溶液漂浮纯化并洗涤两次备用, 或转入 0148 molöL 甘露醇中沉降与保存备用。 (二) 原生质体融合采用以下两种方法: (1) 将一滴融合液加在载玻片上。在倒置显微镜下以手工制备的微吸管(尖端口径约 200 Λm ) , 由亲本原生质体群体中各吸取 1 个原生质体, 置于融合液小滴中。通过手工操作微吸管轻轻移动原生质体, 使之接触与粘连。然后将已紧密粘连的一对原生质体转入中继液中, 静置片刻, 再转入清洗液中除去残余的PEG。最后将其转入培养基中。 (2) 将约 2 m l 融合液加入 3 cm 直径的培养皿中, 在融合液上覆盖一薄层石蜡油。用微吸管将选定的一对原生质体置入融合液中, 按前述步骤进行融合。原生质体酶解、融合、中继和清洗 4 种溶液的成分见表 1。 094 植物学报 36 卷

7期孙蒙祥等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合表1融合程序中所用各种溶液成分表 Table I Com po on of solutons used at different stages of fusin procedure 成分酶解液中继液 Fusion soluton Fusion soluton 清洗液果胶酶 0.5%-1% 红素甘露醇 M anatol 0.1mo 蔗糖 0.35 mon 0.45 mol PE 0.01mo 0.01mo 0.04 mol 0.1 mg/mI 0.1 mg/m 三)观察与摄影以FDA染色观察融合体活性以DAPI染色观察融合体细胞核。在 O lympus CK2倒置显黴镜下操作,用 Olympus mt-2倒置显微镜摄影结果经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体,或用大小不等的原生质体为材料,探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一)融合过程用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版I,1),通过手工操作使其相互接触与粘连(图版I,2),此时2个原生质体会发生猛然的相向压缩,继而每一原生质体由原来的球形变成半球形状态,两者紧粘合(图版I,3)。这一过程一般在2分钟内完成。显微观察显示如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩,则不能继续进行融合,稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程,有必要将融合产物转入含低浓度PEG的中继液中放置10分钟以上,以利融合的完成。在中继液中两原生质体间尚可见一或深或浅的界线,再转入清洗液后,界线逐渐模糊甚至消失(图版Ⅰ,4、5) 经DAPI染色荧光镜检,内含2核,是为同核体(图版Ⅰ,6)。用微吸管将逐对融合的原生质体加以富集,一起转移、清洗(图版Ⅰ,9、10),以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染色反应显示,融合体都是生活的(图版I,11 二)操作方法单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作过程中不致从视野中消失,提高工作效率,可根据不同情况分别采取下列几种具体方法 1.当供试双方原生质体数量较多时,可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

表 1 融合程序中所用各种溶液成分表 T able l Composition of solutions used at different stages of fusion p rocedure 成分 Component 酶解液 Enzym e solution 融合液 Fusion solution (1) 中继液 Fusion solution (2) 清洗液 W ashing solution 果胶酶 Pectinase 015% —1% - - - 纤维素酶 Cellulase R210 1% —115% - - - 甘露醇 M annitol 0148 molöL 011 molöL - - 蔗糖 Sucrose - - 0135 molöL 0145 molöL PEG (6000) - 25% 10% - CaCl2·2H2O - 0101 molöL 0101 molöL 0104 molöL KH2PO 4 011 m göm l 011 m göm l 011 m göm l - pH 516 516 516 7—9 (三) 观察与摄影以 FDA 染色观察融合体活性; 以DA P I染色观察融合体细胞核。在O lympus CK2 倒置显微镜下操作, 用O lympus IM T22 倒置显微镜摄影。结果经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体, 或用大小不等的原生质体为材料, 探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一) 融合过程用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版É , 1) , 通过手工操作使其相互接触与粘连(图版É , 2) , 此时 2 个原生质体会发生猛然的相向压缩, 继而每一原生质体由原来的球形变成半球形状态, 两者紧粘合(图版É , 3)。这一过程一般在 2 分钟内完成。显微观察显示: 如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩, 则不能继续进行融合, 稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程, 有必要将融合产物转入含低浓度 PEG 的中继液中放置 10 分钟以上, 以利融合的完成。在中继液中两原生质体间尚可见一或深或浅的界线, 再转入清洗液后, 界线逐渐模糊甚至消失(图版É , 4、5)。经DA P I染色荧光镜检, 内含 2 核, 是为同核体(图版É , 6)。用微吸管将逐对融合的原生质体加以富集, 一起转移、清洗(图版É , 9、10) , 以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染色反应显示, 融合体都是生活的(图版É , 11)。 (二) 操作方法单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作过程中不致从视野中消失, 提高工作效率, 可根据不同情况分别采取下列几种具体方法: 11 当供试双方原生质体数量较多时, 可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 7 期孙蒙祥等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 194

492 植物学报侧,而在右侧加一大滴融合液,移动载物台,从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。2.当一方原生质体数量很少时,只将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个原生质体并保存在吸管中,然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体,一同样放到融合液中。3.当双方原生质体数量均很少而体积又较小时,可将一方的原生质体先转移到另方原生质体近旁,然后将两者一同吸入微吸管,转入酏合液中。在吸取和释放过程中注意使2个原生质体尽量靠近,以便于在融合液中寻找和操作。4.在载玻片上操作比较方便效率高,观察及摄影效果亦较好,但溶液因易蒸友而改变浓度,需及时补充新的溶液,否则难以进行多次的融台擤作。为此,可改用小培养皿,在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分蒸发。这样操作虽不如前法方便,但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三)关键因素 PEGG浓度在一定温度条件下,PEG浓度对融合速率影响很大。5%以下浓度只能使其粘连,不能完成融合:25%PEG可使融合快速进行,15%左右的PEG融合速度适中,便于仔细观察融合过程及显微摄影 2.渗透压调节剂在维持原生质体活力的条件下,一般以在较低渗的介质中有利于融合。本实验是将原生质体由含0.45moM蔗糖或含0.48moM甘露醇的保存液中转入含0.1moM甘露醇的融合液中融合,然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0.45mo蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而,在为防止水分蒸发而在融合液中补加低渗溶液时,渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版I,7)重新分开 (图版I,8)。 3.原生质体粘底现象原生质体在PEG中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体融合中如果发生这种现象,对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识,作者分下列3种处理作了比较试验,每组做50对原生质体第1组,在融合过程中控制每对原生质体不使粘底。结果100%都可完成融合,第2组,先使一方原生质体粘底,再将另一方原生质体移近与之粘连,结果仅24%完成融合,余则停滞于葫芦形状态等不同阶段第组,将双方原生质体两两成对靠拢但在相互粘连前先使之粘底。结果100%均停滞在仅仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时,原生质体粘底的拉力和原生质体相向压缩的拉力相拮抗,常使原生质体变形拉长。讨论传统的PEG诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是其中的“小规模融合”0,仍然是基于原生质体群体中的随机融合,不能摆脱融合结果的盲目性。本文提出的PEG诱导的成对原生质体融合方法,是PEG技术的一次重要革新。其优点在于:第1,无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素,可以简化前期处理,第2,特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外融合实验时,供试的卵细胞数量很有限,在这种情况下,群体融合是无法奏效的,唯有成对融合可行,第3,可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体,排除未融合的原生质体、亲本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况第4,因此也无需采用 o1994-2008ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:/www.cnki.net

侧, 而在右侧加一大滴融合液, 移动载物台, 从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。21 当一方原生质体数量很少时, 只将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个原生质体并保存在吸管中, 然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体, 一同释放到融合液中。31 当双方原生质体数量均很少而体积又较小时, 可将一方的原生质体先转移到另一方原生质体近旁, 然后将两者一同吸入微吸管, 转入融合液中。在吸取和释放过程中注意使 2 个原生质体尽量靠近, 以便于在融合液中寻找和操作。41 在载玻片上操作比较方便, 效率高, 观察及摄影效果亦较好。但溶液因易蒸发而改变浓度, 需及时补充新的溶液, 否则难以进行多次的融合操作。为此, 可改用小培养皿, 在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分蒸发。这样操作虽不如前法方便, 但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三) 关键因素 11PEGG 浓度在一定温度条件下, PEG 浓度对融合速率影响很大。5% 以下浓度只能使其粘连, 不能完成融合: 25% PEG 可使融合快速进行; 15% 左右的 PEG 融合速度适中, 便于仔细观察融合过程及显微摄影。 21 渗透压调节剂在维持原生质体活力的条件下, 一般以在较低渗的介质中有利于融合[ 9 ]。本实验是将原生质体由含 0145 molöL 蔗糖或含 0148 molöL 甘露醇的保存液中转入含 011 molöL 甘露醇的融合液中融合, 然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0145 molöL 蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而, 在为防止水分蒸发而在融合液中补加低渗溶液时, 渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版É , 7) 重新分开 (图版É , 8)。 31 原生质体粘底现象原生质体在 PEG 中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体融合中如果发生这种现象, 对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识, 作者分下列 3 种处理作了比较试验, 每组做 50 对原生质体: 第 1 组, 在融合过程中控制每对原生质体不使粘底。结果 100% 都可完成融合; 第 2 组, 先使一方原生质体粘底, 再将另一方原生质体移近与之粘连, 结果仅 24% 完成融合, 余则停滞于葫芦形状态等不同阶段; 第 3 组, 将双方原生质体两两成对靠拢, 但在相互粘连前先使之粘底。结果 100% 均停滞在仅仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时, 原生质体粘底的拉力和原生质体相向压缩的拉力相拮抗, 常使原生质体变形拉长。讨论传统的 PEG 诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是其中的“小规模融合”[ 10 ] , 仍然是基于原生质体群体中的随机融合, 不能摆脱融合结果的盲目性。本文提出的 PEG 诱导的成对原生质体融合方法, 是 PEG 技术的一次重要革新。其优点在于: 第 1, 无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素, 可以简化前期处理; 第 2, 特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外融合实验时, 供试的卵细胞数量很有限, 在这种情况下, 群体融合是无法奏效的, 唯有成对融合可行; 第 3, 可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体, 排除未融合的原生质体、亲本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况; 第 4, 因此也无需采用 294 植物学报 36 卷

7期孙蒙祥等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合群体融合时必经的各种筛选系统,可以直接将融合体转入培养。而融合体的筛选常是传统 PEG融合技术的重要限制因素,第5,采用这一系统还可以准确追踪观察融合过程和融合后的发育过程。便于开展有关细胞生物学研究。总之,PEG诱导的成对原生质体融合方法具有与成对原生质体微电融合方法异曲同工的效果,而又无需后者特殊的仪器设备,因而,可以广泛采用。当然,由于成对融合体数量较少,一般的大量培养方法显然是不行的, 必须有特殊的微量培养或饲养系统,方能促使融合体分裂、发育以至稃主植株。在这方面, 前人已有成功的经验1-可供借鉴。参考文献 I Koop H I!, D irk ], Wolff et al Som atic hybrid ization of two selected single cells CellB bl Int Rep, 1983 7: 123- 2 Schweiger H G, D irk J, Koop H U. Indiv idual selecton, culture and m an pulaton of h igher plant cells Theor A emet,198773:69—783 3 Spangenberg G, Schw eiger H G Controlled electofusn of different types of protoplasts including cell reconstitution in B rassica napus L. Eur J Cell B il, 19864151--5 4 Eigel L, Koop H U. T ransfer of dif ned num bers of chbrop lasts using an mp roved subp ro top last/ ro toplast m crofusin procedure: Transfer of only two chbrop lasts leads to variegated progeny. M ol Gen Genet, 1991 227 446-451 5 Koop H U, Eigel L, Sporlein B. Protop lasts in organelle research: T ransfer and transfom at on of plastids Physiol Plnt,199285339—344 6 Maliga P, Lorz H, Lazar G et al Cytop lst"p rotop last fuson for interspecifc chbrop last transfer nN icotiana M ol Gen genet, 1982 185 211-215 7 Kranz E, Bautor J, Lorz H In vitro fertilizat on of single, iso lated gametes of maize mediated by electrofusion Sex Plant Rep,1991412-16 8 Kranz E, Lorz H. In vitro fertilizaton w ith isolted, single gametes results n zygotic em bryogenesis and fertile maize plants The P lant Cell, 1993 5 739-740 9 Kao KN, M hay luk M R Fuson of plant protop hst-techniques h BajjV P Seds, B techno bgy in A griculture and Forestry Vol 8: Plnt Protop last and Genetic Eng neerng I. Berlin: Springer-Vezhg, 1989 277-288 10 Power J B, Chapm an J V. Somate hybridizaton of plants h: D iNon R A ed, Plnt Cell Culture: A Practcal A pproach Oxford: RL Press, 1985 49-54 11夏惠君,周嫦.烟草原生质体微滴培养及细胞早期分裂的定点观察·实验生物学报,1989,22477-481 12 EigelL, Koop H U. Nurse culture of indiv idual cells: Regeneratin of conies from single protoplasts of N tabacun,B rassica napus and H orden vulgare J Plant Physil, 1989. 134 577--581 13 Koop H U, Schweiger H G Regeneration of plants from ind iv dually cultivated protop hsts using an mp icroculture system J P lant Physiol, 1985 121 245--257 14 Koop H U, Schweiger H G Regeneratin of p lants after electrofusion of selected paris of protop lasts EurJ CellB iol, 19853946-49 图版说明除图6和11为荧光显微摄影图7和8为 Nom arsi干涉差摄影外,其余均为明视野图像 1.由微吸管释出的一对叶肉原生质体。×1002-5.一对原生质体的融合过程。注意此过程中两原生质体间的界线逐渐消失。×6006DAPI染色,示同核体中的两个核。×6007、8,在融合过程中由于渗透压骤然降低,使一对本已粘连的原生质体重新部分脱离。×6009、10.用微吸管富集的处于不同融合阶段的融合体群体。×17011,富集的融合体群体FDA染色示生活力。×170 Exp lanton of plate A ll photographs are bright-fiel mages except Figs 6 and 11( fluorescence m ages)and Figs 7 and 8(Nom arski interference contrast m ages) Fig l a pair of protop lsts released from a m op pette X 100 Figs 2-5 Fuson pr of a pair of protop lasts Note that the boundary betw een them gradually disappeared X600 Fig 6A homokaryon stained w ith DAPI X600 Figs 7 and& Partal detachm ent two already adhered protop lasts by sudden bwerng of pressure of the medim. X600 Figs 9 and 10 Popuhtins of the fuson products enriched at different stages of fuson process X170 Fig Il. a populaton of fusin products show ng their viability under fluo rochrom ati reacton X170 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

群体融合时必经的各种筛选系统, 可以直接将融合体转入培养。而融合体的筛选常是传统 PEG 融合技术的重要限制因素; 第 5, 采用这一系统还可以准确追踪观察融合过程和融合后的发育过程。便于开展有关细胞生物学研究。总之, PEG 诱导的成对原生质体融合方法具有与成对原生质体微电融合方法异曲同工的效果, 而又无需后者特殊的仪器设备, 因而, 可以广泛采用。当然, 由于成对融合体数量较少, 一般的大量培养方法显然是不行的, 必须有特殊的微量培养或饲养系统, 方能促使融合体分裂、发育以至再生植株。在这方面, 前人已有成功的经验[ 8, 11—14 ]可供借鉴。参考文献 1 Koop H U ΚD irk JΚW olff D et al. Som atic hybridization of two selected single cells. Cell B iol Int R epΚ1983. 7Π1123— 1128 2 Schw eiger H GΚD irk JΚKoop H U. Individual selectionΚculture and m anipulation of higher p lant cells. T heor A pp l GenetΨ1987. 73Π769—783 3 Spangenberg GΚSchw eiger H G. Controlled electrofusion of different types of p rotop lasts including cell reconstitution in B rassica napus L. E ur J Cell B iolΚ1986. 41Π51—56 4 E igel L Κ Koop H U. T ransfer of difined num bers of chlorop lasts using an imp roved subp rotop lastöp rotop last m icrofusion p rocedureΠT ransfer of only two chlorop lasts leads to variegated p rogeny. M ol Gen GenetΚ 1991. 227Π 446—451 5 Koop H U ΚE igel L ΚSporlein B. P rotop lasts in organelle researchΠT ransfer and transform ation of p lastids. P hy siol P lantΚ1992. 85Π339—344 6 M aliga PΚLorz HΚL azar G et al. Cytop last2p rotop last fusion for interspecific chlorop last transfer in N icotiana. M ol Gen GenetΚ1982. 185Π211—215 7 Kranz EΚBautor JΚLorz H. In v itro fertilization of singleΚ isolated gam etes of m aize m ediated by electrofusion. S ex P lant R epΚ1991. 4Π12—16 8 Kranz EΚLorz H. In v itro fertilization w ith isolatedΚsingle gam etes results in zygotic em bryogenesis and fertile m aize p lants. T he P lant CellΚ1993. 5Π739—746 9 Kao K N ΚM ichaylukM R. Fusion of p lant p rotop last—techniques. InΠBajajV P S eds. ΚB iotechnology in A griculture and Forestry Vol. 8ΠP lant P rotop last and Genetic Engineering É. BerlinΠSp ringer2V ezlagΚ1989. 277—288 10 Pow er J BΚChapm an J V. Som atic hybridization of p lants. InΠD ixon R A ed. Κ P lant Cell CultureΠA P ractical App roach. O xfordΠ IRL P ressΚ1985. 49—54 11 夏惠君Κ周嫦Λ 烟草原生质体微滴培养及细胞早期分裂的定点观察Λ 实验生物学报Κ1989Λ 22Π477—481 12 E igel L ΚKoop H U. N urse culture of individual cellsΠRegeneration of colonies from single p rotop lasts of N icotiana tabacum ΨB rassica napus and H ord eum vulgare. J P lant P hy siolΚ1989. 134Π577—581 13 Koop H U Κ Schw eiger H G. Regeneration of p lants from individually cultivated p rotop lasts using an imp roved m icroculture system. J P lant P hy siolΚ1985. 121Π245—257 14 Koop H U ΚSchw eiger H G. Regeneration of p lants after electrofusion of selected parirs of p rotop lasts. E ur J CellB iolΚ 1985. 39Π46—49 图版说明除图 6 和 11 为荧光显微摄影、图 7 和 8 为Nom arski干涉差摄影外, 其余均为明视野图像。 11 由微吸管释出的一对叶肉原生质体。×100 2—51 一对原生质体的融合过程。注意此过程中两原生质体间的界线逐渐消失。×600 61DA P I染色, 示同核体中的两个核。×600 7、81 在融合过程中由于渗透压骤然降低, 使一对本已粘连的原生质体重新部分脱离。×600 9、101 用微吸管富集的处于不同融合阶段的融合体群体。×170 111 富集的融合体群体, FDA 染色示生活力。×170 Exp lanation of P late A ll photographs are bright2field im ages excep t F igs. 6 and 11 ; fluorescence im agesΓ and F igs. 7 and 8 ;Nom arski interference contrast im agesΓ. F ig. 1. A pair of p rotop lasts released from a m icrop ipette. ×100 F igs. 2—5. Fusion p rocess of a pair of p rotop lasts. Note that the boundary betw een them gradually disappeared. ×600 F ig. 6. A homokaryon stained w ith DA P I. ×600 F igs. 7 and 8. Partial detachm ent two already adhered p rotop lasts by sudden low ering of osmotic p ressure of the m edium. ×600 F igs. 9 and 10. Populations of the fusion p roducts enriched at different stages of fusion p rocess. ×170 F ig. 11. A population of fusion p roducts show ing their viability under fluorochrom atic reaction. ×170 7 期孙蒙祥等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 394

《植物学报》：用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合（武汉大学：孙蒙祥、杨弘远、周 嫦）

《植物学报》：用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合（武汉大学：孙蒙祥、杨弘远、周嫦）