植物学报1994,36(7):489493 Acta Botan ica s in ica 用聚乙二醇诱导选定的成对 原生质体间的融合 孙蒙祥杨弘远周嫦 (武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室,武汉430072) 摘要 微吸管选取单对原生质体,在含聚乙二醇(PEG)的微滴中诱导融合。此法克服了常规 的PEG群体融合方法中的盲目性,能排除一方亲本原生质体自相融合和多个原生质体的融 合,以及未融合的原生质体的混杂,保证融合产物来自选定的成对原生质体,从而使PEG融 合技术精确化。此法在植物细胞工程和细胞生物学研究中有广泛的应用前景 关键词原生质体融合;聚乙二醇 POLYETHYL ENE GLY COL-ND UCED FUSON OF SEL ECTED PA IRS OF SNGLE PRO TO PLASTS Sun M eng "xiang, Yang Hong"yuan and Zhou Chang (Laboratory of Plant Reproductie B ology, College of L fe Science, W whan University, W uhan 430072) Abstract A new m ethod for polyethy lene glycol (PEG )-induced fusin betw een single pairs of an inverted m croscope two def med p ro top lasts w ere selected w ith a hand m ade m icrop pette and transferred in to a drop let of fusin so lutin contain ing 25% PEG (M. W. 6000),0. mol mannitol and 0. 01 mol CaCk. 2HO(pH 5. 6). Slightly moving the p pette caused the p top lasts to contact and adhere to each other the fuson pairs w ere then tran sferred to a o lutin contain ing 10% PEG, 0.35 mol sucro se and 0.01 mol CaCk. 2HO(pH 5.6)for app rox m ately 10 m in, fo llow ed by sub sequent w ash ing w ith a solutin con tan ing °收稿日期1993-12-27接受日期1994-01-21 *国家自然科学基金资助课题。 o1994-2008ChinaAcademicJOumalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:/www.cnki.net
植 物 学 报 1994, 36 (7): 489—493 Acta B otanica S inica 用聚乙二醇诱导选定的成对 原生质体间的融合3 孙蒙祥 杨弘远 周 嫦 (武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室, 武汉 430072) 摘 要 用微吸管选取单对原生质体, 在含聚乙二醇(PEG) 的微滴中诱导融合。此法克服了常规 的 PEG 群体融合方法中的盲目性, 能排除一方亲本原生质体自相融合和多个原生质体的融 合, 以及未融合的原生质体的混杂, 保证融合产物来自选定的成对原生质体, 从而使 PEG 融 合技术精确化。此法在植物细胞工程和细胞生物学研究中有广泛的应用前景。 关键词 原生质体; 融合; 聚乙二醇α POLYETHYL ENE GLYCOL- IND UCED FUSION OF SEL ECTED PA IRS OF SINGL E PROTOPLASTS Sun M eng2xiangΚYang Hong2yuan and Zhou Chang ;L aboratory of P lant R ep rod uctive B iologyΨCollege of L if e S cienceΨW uhan U niversityΨW uhan 430072Γ Abstract A new m ethod for polyethylene glycol ; PEGΓ2induced fusion betw een single pairs of selected p rotop lastsw as developed. T he p rotop lastsw ere p repared from tobacco leaves. U nder an inverted m icroscope two defined p rotop lasts w ere selected w ith a hand2m ade m icrop ipette and transferred into a drop let of fusion solution containing 25% PEG ;M. W. 6000ΓΚ 011 molöL m annitol and 0101 molöL CaC l2·2H 2O ;pH 516Γ. Slightly moving the p ipette caused the p rotop lasts to contact and adhere to each other. the fusion pairs w ere then transferred to a solution containing 10% PEGΚ 0135 molöL sucrose and 0101 molöL CaC l2·2H 2O ; pH 516Γfor app roxim ately 10 m inΚfollow ed by subsequent w ashing w ith a solution containing α 收稿日期: 1993212227 接受日期: 1994201221 3 国家自然科学基金资助课题
0. 45 mol sucro se and 0.04 mol CaCb. 2HO(pH 7-9). Com pared w ith conventional fusin m ethods adop ted to pro top last populaton, the present m ethod can avo d either blind fusin of p rotop lasts bebnging to one partner and fuson among m ult p le p rotop lasts, or the presence of unfused protop lasts, thus en sure the fuson to be precisely at the level of a cted pair of single p top lasts more it is smp le and co potent ality for w ide app licaton in som atic hy brid on and particularly in the case of m all uantity of parental p top lasts such as in v itro in an etic fusion stud ies Key words Pro top last: Fusin Po lyethy lene glyco 通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建,是植物细胞工程的 重要手段。现有的融合技术中,以聚乙二醇(PEG)诱导融合和电融合二者占主要地位。其 中PEG融合技术具有设备简单、操作方便等优点,至今仍然广泛采用。但现行PEG融合 技术是在原生质体群体的条件下进行的,因而在融合产物中除了所欲获得的杂种细胞外 还不可避免地含有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质 体的融合体,从而增加了融合后筛选的困难。此外,在有些情况下,可供融合的亲本原生质 体数量很少,现行的PEG法亦难适用。Koop等创建的成对原生质体微电融合技术克服了 上述缺点,使原生质体融合技术得以精确化,不仅成功地用于体细胞原生质体以、亚原生 质体的融合及细胞包器的转移,而且还被 Kranz等采用,成功地进行了玉米精、卵 的体外融合,并再生了植株。然而,这种微电融合技术需要特殊仪器,难以推广应用。 如果能够使PEG融合技术提高到成对原生质体融合的水平,则将兼有简易与精确两方面 优点。为此,我们做了以下实验,并获得肯定的结果。 材料和方法 实验材料为烟草 v icotiana tabacun l.)品种G-80 (一)原生质体分离 选用大田种植的幼苗10-—20cm长的叶片或试管内种植的无菌苗1.2-2.5m长的 叶片,撕去下表皮,将小块叶片置于酶解液中。在25℃下保温4-6小时,用200目不锈钢 网过滤去残渣,离心去酶液。原生质体以0.45moM蔗糖溶液漂浮纯化并洗涤两次备用, 或转入0.48mo甘露醇中沉降与保存备用。 (二)原生质体融合 采用以下两种方法:(1)将一滴融合液加在载玻片上。在倒置显微镜下以手工制备的 微吸管(尖端口径约200μm),由亲本原生质体群体中各吸取1个原生质体,置于融合液 小滴中。通过手工操作微吸管轻轻移动原生质体,使之接触与粘连。然后将已紧密粘连的 对原生质体转入中继液中,静置片刻,再转入清洗液中除去残余的PEG。最后将其转入 培养基中。(2)将约2m1融合液加入3am直径的培养皿中,在融合液上覆盖一薄层石蜡 油用微吸管将选定的一对原生质体置入融合液中,按前述步骤进行融合。原生质体酶解、 融合、中继和清洗4种溶液的成分见表1。 S1994-2008ChinaAcademicJourmalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
0145 molöL sucrose and 0104 molöL CaC l2·2H 2O ;pH 7—9Γ. Compared w ith conventional fusion m ethods adop ted to p rotop last populationΚ the p resent m ethod can avoid either blind fusion of p rotop lasts belonging to one partner and fusion among m ultip le p rotop lastsΚor the p resence of unfused p rotop lastsΚ thus ensure the fusion to be p recisely at the level of a selected pair of single p rotop lasts. M oreoverΚ it is simp le and convenient enough to show its potentiality for w ide app lication in som atic hybridization and particularly in the case of sm all quantity of parental p rotop lasts such as in v itro intergam etic f usion stud ies. Key words P rotop lastΜFusionΜPolyethylene glycol 通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建, 是植物细胞工程的 重要手段。现有的融合技术中, 以聚乙二醇(PEG) 诱导融合和电融合二者占主要地位。其 中 PEG 融合技术具有设备简单、操作方便等优点, 至今仍然广泛采用。但现行 PEG 融合 技术是在原生质体群体的条件下进行的, 因而在融合产物中除了所欲获得的杂种细胞外, 还不可避免地含有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质 体的融合体, 从而增加了融合后筛选的困难。此外, 在有些情况下, 可供融合的亲本原生质 体数量很少, 现行的 PEG 法亦难适用。Koop 等创建的成对原生质体微电融合技术克服了 上述缺点, 使原生质体融合技术得以精确化, 不仅成功地用于体细胞原生质体[ 1 ]、亚原生 质体[ 2, 3 ]的融合及细胞包器的转移[ 4—6 ] , 而且还被 K ranz 等采用, 成功地进行了玉米精、卵 的体外融合[ 7 ] , 并再生了植株[ 8 ]。然而, 这种微电融合技术需要特殊仪器, 难以推广应用。 如果能够使 PEG 融合技术提高到成对原生质体融合的水平, 则将兼有简易与精确两方面 的优点。为此, 我们做了以下实验, 并获得肯定的结果。 材 料 和 方 法 实验材料为烟草(N icotiana tabacum L. ) 品种 G280。 (一) 原生质体分离 选用大田种植的幼苗 10—20 cm 长的叶片或试管内种植的无菌苗 112—215 cm 长的 叶片, 撕去下表皮, 将小块叶片置于酶解液中。在 25℃下保温 4—6 小时 , 用 200 目不锈钢 网过滤去残渣, 离心去酶液。原生质体以 0145 molöL 蔗糖溶液漂浮纯化并洗涤两次备用, 或转入 0148 molöL 甘露醇中沉降与保存备用。 (二) 原生质体融合 采用以下两种方法: (1) 将一滴融合液加在载玻片上。在倒置显微镜下以手工制备的 微吸管(尖端口径约 200 Λm ) , 由亲本原生质体群体中各吸取 1 个原生质体, 置于融合液 小滴中。通过手工操作微吸管轻轻移动原生质体, 使之接触与粘连。然后将已紧密粘连的 一对原生质体转入中继液中, 静置片刻, 再转入清洗液中除去残余的PEG。最后将其转入 培养基中。 (2) 将约 2 m l 融合液加入 3 cm 直径的培养皿中, 在融合液上覆盖一薄层石蜡 油。用微吸管将选定的一对原生质体置入融合液中, 按前述步骤进行融合。原生质体酶解、 融合、中继和清洗 4 种溶液的成分见表 1。 094 植 物 学 报 36 卷
7期 孙蒙祥等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 表1融合程序中所用各种溶液成分表 Table I Com po on of solutons used at different stages of fusin procedure 成分 酶解液 中继液 Fusion soluton Fusion soluton 清洗液 果胶酶 0.5%-1% 红素 甘露醇 M anatol 0.1mo 蔗糖 0.35 mon 0.45 mol PE 0.01mo 0.01mo 0.04 mol 0.1 mg/mI 0.1 mg/m 三)观察与摄影 以FDA染色观察融合体活性以DAPI染色观察融合体细胞核。在 O lympus CK2倒 置显黴镜下操作,用 Olympus mt-2倒置显微镜摄影 结果 经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最 好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体,或用大小不等的原生质体为 材料,探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一)融合过程 用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版I,1),通过手工操作 使其相互接触与粘连(图版I,2),此时2个原生质体会发生猛然的相向压缩,继而每一原 生质体由原来的球形变成半球形状态,两者紧粘合(图版I,3)。这一过程一般在2分钟内 完成。显微观察显示如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩,则不能继续 进行融合,稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种 情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程,有必要将融合产物 转入含低浓度PEG的中继液中放置10分钟以上,以利融合的完成。在中继液中两原生质 体间尚可见一或深或浅的界线,再转入清洗液后,界线逐渐模糊甚至消失(图版Ⅰ,4、5) 经DAPI染色荧光镜检,内含2核,是为同核体(图版Ⅰ,6)。用微吸管将逐对融合的原生 质体加以富集,一起转移、清洗(图版Ⅰ,9、10),以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染 色反应显示,融合体都是生活的(图版I,11 二)操作方法 单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作 过程中不致从视野中消失,提高工作效率,可根据不同情况分别采取下列几种具体方法 1.当供试双方原生质体数量较多时,可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
表 1 融合程序中所用各种溶液成分表 T able l Composition of solutions used at different stages of fusion p rocedure 成分 Component 酶解液 Enzym e solution 融合液 Fusion solution (1) 中继液 Fusion solution (2) 清洗液 W ashing solution 果胶酶 Pectinase 015% —1% - - - 纤维素酶 Cellulase R210 1% —115% - - - 甘露醇 M annitol 0148 molöL 011 molöL - - 蔗 糖 Sucrose - - 0135 molöL 0145 molöL PEG (6000) - 25% 10% - CaCl2·2H2O - 0101 molöL 0101 molöL 0104 molöL KH2PO 4 011 m göm l 011 m göm l 011 m göm l - pH 516 516 516 7—9 (三) 观察与摄影 以 FDA 染色观察融合体活性; 以DA P I染色观察融合体细胞核。在O lympus CK2 倒 置显微镜下操作, 用O lympus IM T22 倒置显微镜摄影。 结 果 经蔗糖漂浮并洗涤后的烟草原生质体基本上是纯净和有生活力的。挑选其中状态最 好的叶肉原生质体或不含叶绿体的维管薄壁细胞原生质体, 或用大小不等的原生质体为 材料, 探索并建立原生质体成对融合的操作技术。 (一) 融合过程 用微吸管将选出的一对叶肉原生质体释入融合液中以后(图版É , 1) , 通过手工操作 使其相互接触与粘连(图版É , 2) , 此时 2 个原生质体会发生猛然的相向压缩, 继而每一原 生质体由原来的球形变成半球形状态, 两者紧粘合(图版É , 3)。这一过程一般在 2 分钟内 完成。显微观察显示: 如果仅有原生质体间的粘连而不发生猛然的相向压缩, 则不能继续 进行融合, 稍加触动即可重新分开。即使通过相向压缩过程也还有重新脱离的可能。这种 情况多在将融合产物直接转入清洗液时出现。为了防止上述逆向过程, 有必要将融合产物 转入含低浓度 PEG 的中继液中放置 10 分钟以上, 以利融合的完成。在中继液中两原生质 体间尚可见一或深或浅的界线, 再转入清洗液后, 界线逐渐模糊甚至消失(图版É , 4、5)。 经DA P I染色荧光镜检, 内含 2 核, 是为同核体(图版É , 6)。用微吸管将逐对融合的原生 质体加以富集, 一起转移、清洗(图版É , 9、10) , 以便进行后续的培养。荧光素二醋酸酯染 色反应显示, 融合体都是生活的(图版É , 11)。 (二) 操作方法 单对原生质体的融合全过程必须在倒置显微镜下进行。为了使所观察的对象在操作 过程中不致从视野中消失, 提高工作效率, 可根据不同情况分别采取下列几种具体方法: 11 当供试双方原生质体数量较多时, 可分别将两滴原生质体悬浮液加在载玻片左 7 期 孙蒙祥等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 194
492 植物学报 侧,而在右侧加一大滴融合液,移动载物台,从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液 中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。2.当一方原生质体数量很少时,只 将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个 原生质体并保存在吸管中,然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体,一同样放到融合液 中。3.当双方原生质体数量均很少而体积又较小时,可将一方的原生质体先转移到另 方原生质体近旁,然后将两者一同吸入微吸管,转入酏合液中。在吸取和释放过程中注意 使2个原生质体尽量靠近,以便于在融合液中寻找和操作。4.在载玻片上操作比较方便 效率高,观察及摄影效果亦较好,但溶液因易蒸友而改变浓度,需及时补充新的溶液,否则 难以进行多次的融台擤作。为此,可改用小培养皿,在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分 蒸发。这样操作虽不如前法方便,但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三)关键因素 PEGG浓度在一定温度条件下,PEG浓度对融合速率影响很大。5%以下浓度只 能使其粘连,不能完成融合:25%PEG可使融合快速进行,15%左右的PEG融合速度适 中,便于仔细观察融合过程及显微摄影 2.渗透压调节剂在维持原生质体活力的条件下,一般以在较低渗的介质中有利于 融合。本实验是将原生质体由含0.45moM蔗糖或含0.48moM甘露醇的保存液中 转入含0.1moM甘露醇的融合液中融合,然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0.45mo蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而,在为防止水分蒸发而在融合液中 补加低渗溶液时,渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版I,7)重新分开 (图版I,8)。 3.原生质体粘底现象原生质体在PEG中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体 融合中如果发生这种现象,对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识,作者分 下列3种处理作了比较试验,每组做50对原生质体第1组,在融合过程中控制每对原生 质体不使粘底。结果100%都可完成融合,第2组,先使一方原生质体粘底,再将另一方原 生质体移近与之粘连,结果仅24%完成融合,余则停滞于葫芦形状态等不同阶段第 组,将双方原生质体两两成对靠拢但在相互粘连前先使之粘底。结果100%均停滞在仅 仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时,原生质体粘底的拉力和原生质体相向 压缩的拉力相拮抗,常使原生质体变形拉长。 讨论 传统的PEG诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是 其中的“小规模融合”0,仍然是基于原生质体群体中的随机融合,不能摆脱融合结果的 盲目性。本文提出的PEG诱导的成对原生质体融合方法,是PEG技术的一次重要革新。 其优点在于:第1,无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素,可以简 化前期处理,第2,特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外 融合实验时,供试的卵细胞数量很有限,在这种情况下,群体融合是无法奏效的,唯有成对 融合可行,第3,可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体,排除未融合的原生质体、亲 本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况第4,因此也无需采用 o1994-2008ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:/www.cnki.net
侧, 而在右侧加一大滴融合液, 移动载物台, 从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液 中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。21 当一方原生质体数量很少时, 只 将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个 原生质体并保存在吸管中, 然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体, 一同释放到融合液 中。31 当双方原生质体数量均很少而体积又较小时, 可将一方的原生质体先转移到另一 方原生质体近旁, 然后将两者一同吸入微吸管, 转入融合液中。在吸取和释放过程中注意 使 2 个原生质体尽量靠近, 以便于在融合液中寻找和操作。41 在载玻片上操作比较方便, 效率高, 观察及摄影效果亦较好。但溶液因易蒸发而改变浓度, 需及时补充新的溶液, 否则 难以进行多次的融合操作。为此, 可改用小培养皿, 在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分 蒸发。这样操作虽不如前法方便, 但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三) 关键因素 11PEGG 浓度 在一定温度条件下, PEG 浓度对融合速率影响很大。5% 以下浓度只 能使其粘连, 不能完成融合: 25% PEG 可使融合快速进行; 15% 左右的 PEG 融合速度适 中, 便于仔细观察融合过程及显微摄影。 21 渗透压调节剂 在维持原生质体活力的条件下, 一般以在较低渗的介质中有利于 融合[ 9 ]。本实验是将原生质体由含 0145 molöL 蔗糖或含 0148 molöL 甘露醇的保存液中 转入含 011 molöL 甘露醇的融合液中融合, 然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0145 molöL 蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而, 在为防止水分蒸发而在融合液中 补加低渗溶液时, 渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版É , 7) 重新分开 (图版É , 8)。 31 原生质体粘底现象 原生质体在 PEG 中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体 融合中如果发生这种现象, 对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识, 作者分 下列 3 种处理作了比较试验, 每组做 50 对原生质体: 第 1 组, 在融合过程中控制每对原生 质体不使粘底。结果 100% 都可完成融合; 第 2 组, 先使一方原生质体粘底, 再将另一方原 生质体移近与之粘连, 结果仅 24% 完成融合, 余则停滞于葫芦形状态等不同阶段; 第 3 组, 将双方原生质体两两成对靠拢, 但在相互粘连前先使之粘底。结果 100% 均停滞在仅 仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时, 原生质体粘底的拉力和原生质体相向 压缩的拉力相拮抗, 常使原生质体变形拉长。 讨 论 传统的 PEG 诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是 其中的“小规模融合”[ 10 ] , 仍然是基于原生质体群体中的随机融合, 不能摆脱融合结果的 盲目性。本文提出的 PEG 诱导的成对原生质体融合方法, 是 PEG 技术的一次重要革新。 其优点在于: 第 1, 无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素, 可以简 化前期处理; 第 2, 特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外 融合实验时, 供试的卵细胞数量很有限, 在这种情况下, 群体融合是无法奏效的, 唯有成对 融合可行; 第 3, 可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体, 排除未融合的原生质体、亲 本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况; 第 4, 因此也无需采用 294 植 物 学 报 36 卷
7期 孙蒙祥等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 群体融合时必经的各种筛选系统,可以直接将融合体转入培养。而融合体的筛选常是传统 PEG融合技术的重要限制因素,第5,采用这一系统还可以准确追踪观察融合过程和融合 后的发育过程。便于开展有关细胞生物学研究。总之,PEG诱导的成对原生质体融合方法 具有与成对原生质体微电融合方法异曲同工的效果,而又无需后者特殊的仪器设备,因 而,可以广泛采用。当然,由于成对融合体数量较少,一般的大量培养方法显然是不行的, 必须有特殊的微量培养或饲养系统,方能促使融合体分裂、发育以至稃主植株。在这方面, 前人已有成功的经验1-可供借鉴。 参考文献 I Koop H I!, D irk ], Wolff et al Som atic hybrid ization of two selected single cells CellB bl Int Rep, 1983 7: 123- 2 Schweiger H G, D irk J, Koop H U. Indiv idual selecton, culture and m an pulaton of h igher plant cells Theor A emet,198773:69—783 3 Spangenberg G, Schw eiger H G Controlled electofusn of different types of protoplasts including cell reconstitution in B rassica napus L. Eur J Cell B il, 19864151--5 4 Eigel L, Koop H U. T ransfer of dif ned num bers of chbrop lasts using an mp roved subp ro top last/ ro toplast m crofusin procedure: Transfer of only two chbrop lasts leads to variegated progeny. M ol Gen Genet, 1991 227 446-451 5 Koop H U, Eigel L, Sporlein B. Protop lasts in organelle research: T ransfer and transfom at on of plastids Physiol Plnt,199285339—344 6 Maliga P, Lorz H, Lazar G et al Cytop lst"p rotop last fuson for interspecifc chbrop last transfer nN icotiana M ol Gen genet, 1982 185 211-215 7 Kranz E, Bautor J, Lorz H In vitro fertilizat on of single, iso lated gametes of maize mediated by electrofusion Sex Plant Rep,1991412-16 8 Kranz E, Lorz H. In vitro fertilizaton w ith isolted, single gametes results n zygotic em bryogenesis and fertile maize plants The P lant Cell, 1993 5 739-740 9 Kao KN, M hay luk M R Fuson of plant protop hst-techniques h BajjV P Seds, B techno bgy in A griculture and Forestry Vol 8: Plnt Protop last and Genetic Eng neerng I. Berlin: Springer-Vezhg, 1989 277-288 10 Power J B, Chapm an J V. Somate hybridizaton of plants h: D iNon R A ed, Plnt Cell Culture: A Practcal A pproach Oxford: RL Press, 1985 49-54 11夏惠君,周嫦.烟草原生质体微滴培养及细胞早期分裂的定点观察·实验生物学报,1989,22477-481 12 EigelL, Koop H U. Nurse culture of indiv idual cells: Regeneratin of conies from single protoplasts of N tabacun,B rassica napus and H orden vulgare J Plant Physil, 1989. 134 577--581 13 Koop H U, Schweiger H G Regeneration of plants from ind iv dually cultivated protop hsts using an mp icroculture system J P lant Physiol, 1985 121 245--257 14 Koop H U, Schweiger H G Regeneratin of p lants after electrofusion of selected paris of protop lasts EurJ CellB iol, 19853946-49 图版说明 除图6和11为荧光显微摄影图7和8为 Nom arsi干涉差摄影外,其余均为明视野图像 1.由微吸管释出的一对叶肉原生质体。×1002-5.一对原生质体的融合过程。注意此过程中两原生质体间的 界线逐渐消失。×6006DAPI染色,示同核体中的两个核。×6007、8,在融合过程中由于渗透压骤然降低,使一对 本已粘连的原生质体重新部分脱离。×6009、10.用微吸管富集的处于不同融合阶段的融合体群体。×17011,富 集的融合体群体FDA染色示生活力。×170 Exp lanton of plate A ll photographs are bright-fiel mages except Figs 6 and 11( fluorescence m ages)and Figs 7 and 8(Nom arski interference contrast m ages) Fig l a pair of protop lsts released from a m op pette X 100 Figs 2-5 Fuson pr of a pair of protop lasts Note that the boundary betw een them gradually disappeared X600 Fig 6A homokaryon stained w ith DAPI X600 Figs 7 and& Partal detachm ent two already adhered protop lasts by sudden bwerng of pressure of the medim. X600 Figs 9 and 10 Popuhtins of the fuson products enriched at different stages of fuson process X170 Fig Il. a populaton of fusin products show ng their viability under fluo rochrom ati reacton X170 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
群体融合时必经的各种筛选系统, 可以直接将融合体转入培养。而融合体的筛选常是传统 PEG 融合技术的重要限制因素; 第 5, 采用这一系统还可以准确追踪观察融合过程和融合 后的发育过程。便于开展有关细胞生物学研究。总之, PEG 诱导的成对原生质体融合方法 具有与成对原生质体微电融合方法异曲同工的效果, 而又无需后者特殊的仪器设备, 因 而, 可以广泛采用。当然, 由于成对融合体数量较少, 一般的大量培养方法显然是不行的, 必须有特殊的微量培养或饲养系统, 方能促使融合体分裂、发育以至再生植株。在这方面, 前人已有成功的经验[ 8, 11—14 ]可供借鉴。 参 考 文 献 1 Koop H U ΚD irk JΚW olff D et al. Som atic hybridization of two selected single cells. Cell B iol Int R epΚ1983. 7Π1123— 1128 2 Schw eiger H GΚD irk JΚKoop H U. Individual selectionΚculture and m anipulation of higher p lant cells. T heor A pp l GenetΨ1987. 73Π769—783 3 Spangenberg GΚSchw eiger H G. Controlled electrofusion of different types of p rotop lasts including cell reconstitution in B rassica napus L. E ur J Cell B iolΚ1986. 41Π51—56 4 E igel L Κ Koop H U. T ransfer of difined num bers of chlorop lasts using an imp roved subp rotop lastöp rotop last m icrofusion p rocedureΠT ransfer of only two chlorop lasts leads to variegated p rogeny. M ol Gen GenetΚ 1991. 227Π 446—451 5 Koop H U ΚE igel L ΚSporlein B. P rotop lasts in organelle researchΠT ransfer and transform ation of p lastids. P hy siol P lantΚ1992. 85Π339—344 6 M aliga PΚLorz HΚL azar G et al. Cytop last2p rotop last fusion for interspecific chlorop last transfer in N icotiana. M ol Gen GenetΚ1982. 185Π211—215 7 Kranz EΚBautor JΚLorz H. In v itro fertilization of singleΚ isolated gam etes of m aize m ediated by electrofusion. S ex P lant R epΚ1991. 4Π12—16 8 Kranz EΚLorz H. In v itro fertilization w ith isolatedΚsingle gam etes results in zygotic em bryogenesis and fertile m aize p lants. T he P lant CellΚ1993. 5Π739—746 9 Kao K N ΚM ichaylukM R. Fusion of p lant p rotop last—techniques. InΠBajajV P S eds. ΚB iotechnology in A griculture and Forestry Vol. 8ΠP lant P rotop last and Genetic Engineering É. BerlinΠSp ringer2V ezlagΚ1989. 277—288 10 Pow er J BΚChapm an J V. Som atic hybridization of p lants. InΠD ixon R A ed. Κ P lant Cell CultureΠA P ractical App roach. O xfordΠ IRL P ressΚ1985. 49—54 11 夏惠君Κ周嫦Λ 烟草原生质体微滴培养及细胞早期分裂的定点观察Λ 实验生物学报Κ1989Λ 22Π477—481 12 E igel L ΚKoop H U. N urse culture of individual cellsΠRegeneration of colonies from single p rotop lasts of N icotiana tabacum ΨB rassica napus and H ord eum vulgare. J P lant P hy siolΚ1989. 134Π577—581 13 Koop H U Κ Schw eiger H G. Regeneration of p lants from individually cultivated p rotop lasts using an imp roved m icroculture system. J P lant P hy siolΚ1985. 121Π245—257 14 Koop H U ΚSchw eiger H G. Regeneration of p lants after electrofusion of selected parirs of p rotop lasts. E ur J CellB iolΚ 1985. 39Π46—49 图 版 说 明 除图 6 和 11 为荧光显微摄影、图 7 和 8 为Nom arski干涉差摄影外, 其余均为明视野图像。 11 由微吸管释出的一对叶肉原生质体。×100 2—51 一对原生质体的融合过程。注意此过程中两原生质体间的 界线逐渐消失。×600 61DA P I染色, 示同核体中的两个核。×600 7、81 在融合过程中由于渗透压骤然降低, 使一对 本已粘连的原生质体重新部分脱离。×600 9、101 用微吸管富集的处于不同融合阶段的融合体群体。×170 111 富 集的融合体群体, FDA 染色示生活力。×170 Exp lanation of P late A ll photographs are bright2field im ages excep t F igs. 6 and 11 ; fluorescence im agesΓ and F igs. 7 and 8 ;Nom arski interference contrast im agesΓ. F ig. 1. A pair of p rotop lasts released from a m icrop ipette. ×100 F igs. 2—5. Fusion p rocess of a pair of p rotop lasts. Note that the boundary betw een them gradually disappeared. ×600 F ig. 6. A homokaryon stained w ith DA P I. ×600 F igs. 7 and 8. Partial detachm ent two already adhered p rotop lasts by sudden low ering of osmotic p ressure of the m edium. ×600 F igs. 9 and 10. Populations of the fusion p roducts enriched at different stages of fusion p rocess. ×170 F ig. 11. A population of fusion p roducts show ing their viability under fluorochrom atic reaction. ×170 7 期 孙蒙祥等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 394
孙蒙详等:用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 图版I Sun Meng-xiang et al Polyethy lene G- Induced Fuson of Selected Pairs of single protop lasts P late ②06e● S See exp lanton at the end of text 2o1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net
孙蒙详等: 用聚乙二醇诱导选定的成对原生质体间的融合 图版É Sun M eng2xiang et al. : Polyethylene Glycol2Induced Fusion of Selected Pairs of Single P rotop lasts P late É See exp lanation at the end of text
