蛋白质技术手册 > 汪家政范明主编 .3-62 图书馆 科学出版社
刖 生命科学是21世纪的带头学科,在现代生命科学最前沿的研 究领域中,以研究人类基因组结构和功能为主的“蛋白质组计划 已经成为分子生物学的重要课题,并带动了整个生命科学的发展 随着科学不断发展,研究手段日新月异,我们从实践中体会到,在 蛋白质研究的日常工作中,一本关于蛋白质研究方法的工具书会 发挥很大的作用。1990年前后出版的《分子克隆实验指南)使核 酸操作技术实现了标准化,推动了“基因组计划”的发展和实现。 由于蛋白质结构和性质的复杂与多样性,难以归纳出般性的分 析操作规程。因而缺少有关蛋白质技术方面的工具书。我们参考 了“ Protein methods”"(1996年第二版)一书的内容和编写方法,结 合自己多年研究实践的经验和体会,编写了这本(蛋白质技术手 册》。内容包括蛋白质的准备、提取、溶解浓度测定、浓缩、电泳、 层析、免疫印迹、晶体培养和一级结构测定等,共14章。这是一本 适用于各种蛋白质分析和操作的实验指南。为实验者提供实用、有 效的蛋白质操作信息,使实验能够直接、快捷地进行,是我们编写 这本书的心愿。书中插图的制作由北京医科大学人民跃院李钧完 成 本书在出版时得到军事医学科学院基础医学研究所和院科技 部的比版经费资助
目录 第一章蛋白质分高的准备 甲即曲甲D中中 1.I引 1.2缓冲液 1.2.1缓冲液的性质 1.2.2缓冲液配制…… 1.2.3浓度对缓冲液pH值的影响…5 1.2.4某些缓冲液使用时的注意事项 6 1.2.5防止缓冲液受污染………………7 1.2.6水的纯度… 1.3盐、金属离子和螯合剂… 1.3.1离子强度… 1.3.2二价阳离子……… 7 1.3.3螯合剂……………8 1.4还原剂… 8 1.4.1总则 8 1.4.2特殊情况 甲p甲+ L.5去垢剂 9 1.5.!去垢剂的分类… 1.5.2蛋白质溶解的初始操作步骤………3 1.6蛋白质的环境因素……… 14 1.6.1表面效应…… ………14 1.6.2温度… 14 ↓.6.3储存…… 5 1.7蛋白酶抑制剂 16 1.7.1常用抑制剂… 1.7.2蛋白酶抑制剂混合使用………… 18 第二章蛋白质的提取和溶解… ………20
2.1引言 20 2.2细胞破碎和蛋白质溶解……… …21 2.2.1匀浆… 21 2.2.2超声… 2.2.3高压匀浆 25 2.2.4研磨 2.2.5(高速)珠磨……………………27 2.2.6酶溶………………………………27 2.2.7化学滲透… 2.2.8其他方法………………………29 2.3包涵体蛋白质的溶解 2.3.1包涵体蛋白质的溶解及复性… 2.3.2防止包涵体形成 33 第三章蛋白质浓度测定… 3.1280纳米(A280)光吸收法…… 3.1.1提要… 888 3.1.2设备…………… 3.1.3试剂 ……………………………39 3.1.4操作步骤……… ……………39 3.1.5注意事项 3.2 Bradford检测法 ∴…………………………42 3.2.1提要……… 42 3.2.2设备………………… 3,2.3试剂 b甲 ………43 3.2.4操作步骤… 43 注意事项 ……46 3.31owry检测法… ……………………47 3.3.1提要…… ……………………47 3.3.2设备 3.3.3试剂 48
3.3.4操作步骤………………………………… 3.3.5注意事项 …………50 3.4二喹啉甲酸(BCA)检测法 3.4.1提要 5 3.4.2设备… ……52 3.4.3试剂 52 3.4.4操作步骤……………………………52 3.4.5注意事项…………………… 3.5斑点滤膜结合法…………… D省《鲁 3.5.1概述 ……………54 3.5.2操作步骤 ………54 3.6干扰物质表 55 第四章蛋白质溶液的浓缩……… 4.1分析方法… 4.1.l三氯醋酸沉淀法……… 4.1.2丙醐沉淀法………………… 4.1.3免疫沉淀法 …62 4.2制备方法…………… 4.2.I硫酸铵沉淀法…… 5 4.2.2有机溶剂沉淀法 …68 4.2.3聚乙二醇沉淀法… 4.2.4超滤法… 70 4.2.5透析法 72 4.2.6离子交换层析和冷冻干燥法简述 74 第五章变性条件下的凝胶电泳 甲·+,甲中·甲非甲 S.tSI)s-聚丙烯酰胺凝胶电泳……… 5.1.l原理 5.1.2设备 5.1.3制胶 79 5.1.4制备样品和上样……… ………87
5.1.5电泳 5.1.6考马斯亮蓝染色……………… 90 5.1.7银染色 5.1.8干胶 1.9讨论 5.1.10安全注意事项…… 100 5.2梯度胶 5.2.1引言… ……101 5.2.2仪器 101 5.2.3凝胶的制备… 5.3SI)s-尿素胶…… 5.3.1引言 5.3.2制胶…………………………I04 5.4其他方法 105 5.4.1放射性标记样品的检测 05 5.4.2分子量的测定……………………105 5.4.3蛋白质定量… …I7 5.4.4电泳后蛋白质的洗脱 I(8 第六章非变性条件下的凝胶电泳 6.1引言 6.2不连续非变性凝胶电泳……2 6.2.【设备… 6.2.2制胶…… 6.2.3样品制备… 117 6.2.4电泳 l18 6.2.5凝胶染色 6.2.6连续非变性凝胶电泳 6.3相关的方法 ,甲· 6.3.1蛋白质分子量的测定 +;··;日-, 120 6.3.2电泳后酶活性的测定… I22
第七章等电聚焦和双向凝胶电泳………124 7.1等电聚焦… 124 7.1.1原理… 124 7.1.2主要仪器……………………125 7.1.3灌制等电聚焦凝胶………………125 7.1.4样品制备和上样……………………128 7.1.5等电聚焦电泳…… …………129 7.1.6聚焦后处理 L30 7.1.7天然等电聚焦电泳的修正方案 130 7.1.8讨论 131 7.2固相pH梯度等电聚焦电泳…………………I34 7.2.1简介 ……………………134 7.2.2仪器 ······ *·:·····∴ 135 7.2.3制备等电聚焦凝胶 ………………135 7.2.4样品制备和上样 7.2.5等电聚焦也泳… ………138 7.2.6聚焦后处理……… ………139 7.2.7讨论… 139 7.3双问凝胶电泳… ……………140 7.3.!简介 7.3.仪器 …………………140 7.3.3操作步骤 ……………………141 7.3.4讨论 …………………………144 第八章蛋白质的毛细管电泳分析 ……………148 8.1引;……………… ……148 8.2影响分离效率的几个因教…… 149 8.3柱制备技术… 8.3.!键合涂层… …151 8.3.2吸附涂… 15l 8.4不同分离条件的影啊 ……152
8.5毛细管电泳检测器 ……152 8.6实验操作 1153 8.6.1实验步骤 153 8.6.2操作条件选择 ………………………………153 8.6.3毛细管区带电泳 155 8.6.4毛细管等电聚焦 8.6.5毛细管凝胶电泳… ………159 8.6.6亲和毛细管电泳… 8.7应用实例 8.7.1聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳柱的制备 16l 8.7.2毛细管凝胶电泳分离蛋白质 l62 8.7.3毛细管等电聚焦… 163 第九章免疫印迹 ………………………166 9.引言… 9.1.1免疫印迹用膜 ……167 9.1.2将蛋白质固定在膜上的其他应用 167 9.2免疫印迹操作 9.2.1仪器……………… 9.2.2试剂………………… ………l68 9.2.3操作步骤 …169 9.2.4其他检测方法的修正方案 ………178 9.2.5总蛋白质染色 181 9.2.6免疫印迹清除………………………182 9.3讨论 9.3.1膜的储存…… 9.3.2转移异常……… ………………183 9.3.3免疫印迹的其他应用………… 183 第十章离子交换层析… 189 1(3.1蛋白质纯化… ………189 10.1.1引言 新,,由身·P·山 vt·
10.L.2方法… 10.2蛋白质溶液的浓缩…………………………………210 10.3批量层析 ……210 第十一章凝胶过滤层析… 普甲中··.、甲甲·●p甲甲由省,,曲曲‘由·、 11.1蛋白质的纯化……… ……………………212 11.1.2方法 219 11.2更换蛋白质的缓冲液… 229 第十二章亲和层析 12.1引言…………………………………231 12.2亲和柱的制备……… 甲甲··鲁· 12.2.1配基固相化技术…… 12.2.2非特异洗脱的策略… 236 12.3特异分离技术……… 238 12.3.1抗体…… ……………238 12.3.2核酸 246 12.3.3凝集素 ……………250 12.3.4染料配基… 12.3.5固相化金属亲和层析… 257 12.3.6疏水作用层析… 第十三章蛋白质的晶体培养——悬滴结晶… 264 13.1引言………………………………264 13.2悬滴结晶法…… ………………266 13.2.1结晶原理 66 13.2.2第·阶段操作步骤…69 13.3设计最优结晶方案… 面44普 278 13.3.1稀溶液基质的微调……………279 13.3.2初始筛选的扩展………… 13.3.3蛋白质结晶的灵活性与困难… 284 第十四章cDNA法推断蛋白质的一级结构 287
14.1引言…………………………………287 14.2一般策略 鲁·,甲甲,甲甲甲 ………………………287 14.2.1蛋白质的纯化和肽段氨基酸序列分析…………287 14.2.2引物的设计……………………289 14.2.3用PCR扩增目的cNA片段 291 14.2.4cDNA的克隆及测序 14.2.5cDNA序列的分析及蛋白质…级结构的 确定… ……………………292 14.3PK-120的纯化及肽段氨基酸序列分析…………294 14.3.1仪器及材料… 294 14.3.2PK-120的纯化………………… 14.3,3分离纯化肽段及测定氨基酸序列………296 14.4部分分解多肽两端有关的CR法筛选PK-120 基因…… ……297 14.4.1仪器及材料… 14.4.2引物设计 ……………298 14.4.3R扩增… 14.4.4凝胶电泳提取!\A ·中 14.4.5测定碱基序列 20 0)9 14.5PK-120cDNA克隆 14.5.1仪器及材料……… …3 14.5.2杂交反应… 3H() 14.5.3c)A折测PK12级结构的特f.………3 附录1常用化学物质分子量 3(4 附录2一些蛋白质的分子量和等电点 308 附录3硫酸铵沉淀剂表… 310 附录4分光光度曲线 32
