第5卷第1期 自然科学进展国家重点实验室通讯 1995年1月 柑桔原生质体培养与融合研究 邓秀新章文才 (华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070) 关键词柑桔原生质体融合体细胞杂种育种 柑桔是我国南方最为重要的水果种类.近些年,生产中存在的病毒病危害以及柑桔北缘 地带的周期性冻害已经给柑桔生产造成了巨大的经济损失.这些问题有待育种工作者去解 决 柑桔育种周期长、占地广,以及长期无性繁殖造成遗传上高度杂合性均影响柑桔有性 杂交与遗传育种研究的开展此外,柑桔类植物的多胚性,即大多数柑桔种类(品种)具有 珠心胚现象.近几十年来由于追求无核性状,致如今生产中的主栽品种大多是雄性 或/和雌性不育类型;这两个特殊困难使得柑洁的有性交工作更难开展有性杂交,这一 在品种改良和性状遗传规律研究中的重要途径在柑桔育种中没能起到应有的作用.对几 十年来注册的柑桔品种进行分析也说明了这一点,柑桔品种有26.1%来自芽变,即一种体 细胞突变;59.4%来自珠心苗变异,实际上还是体细胞突变通过有性杂交选育出来的品 种占的比例很小2,这一育种途径的不畅也妨碍了对柑桔性状遗传规律的认识柑桔遗传研 究落后于其它农作物,因此,开创一条有效途径,使柑桔不同种(品种)间实现基因重组, 一直是柑桔育种者研究的重点.70年代后,植物原生质体培养及融合技术取得的成就为解 决柑桔育种遇到的珠心胚干扰,性器官败育提供了手段本研究自1985年始,首先建立柑 桔原生质体再生技术体系,然后,建立起柑桔原生质体融合及杂种植株再生技术体系,最 后,对这一技术体系进行改进,使之能应用于育种实践本文对已经取得的结果报道如下 1胚性愈伤组织的诱导 胚性愈伤组织是进行柑桔原生质体培养和融合的最佳起始材料.迄今,还没有一例关于 胚性愈伤组织(或悬浮细胞系)之外的原生质体培养再生的报道3~51 柑桔胚性愈伤组织一般是由开花后2~8周的珠心组织诱导产生吴金虎等在M 基本培养基上附加iAA0.1~0.5mg/,kT0.~1.0mg/L,接种开花后7周的珠心组织, 诱导出4个品种的胚性愈伤组织,并发现不同品种产生愈伤组织的能力与该品种每种子含 珠心胚的数目相关,在4个供试品种中,每种子胚数从多到少依次为椪柑、锦橙、桃叶橙和 本地早它们产生胚性愈伤组织的百分比分别为48.5%,21.2%,19.8%和2.2%.对于一些 单胚性种或品种,以及个别的多胚性种,较难获得胚性愈伤组织.如枳(Poncirus trifoliata 19940307收,194-0406收修改稿 国家自然科学基金项目 01994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing house. all rights reserved. http: //www.cnki.net
第 卷 第 期 自然科学进展 — 国家重 点实验室通讯 卯 年 月 柑桔原生质体培养与融合研究 邓 秀新 章文才 华中农业大学作物 遗传改 良国家重点 实验室 , 武汉 月义刃 关键词 柑桔 原 生质体融合 体细胞杂种 育种 柑桔是我 国南方最 为重要 的水果种类 近些年 , 生产中存在 的病毒病危害以及 柑桔 北 缘 地带的周 期性 冻害 已 经给柑桔 生产造成 了 巨 大 的 经 济 损失 这 些 问题 有 待 育 种 工 作 者 去解 决 柑桔育种周期 长 、 占地广 , 以及长期无性繁殖造成遗传上高度杂合性 , 均影 响柑桔有 性 杂交 与 遗传育种研究 的开展 此外 , 柑桔类植物 的多 胚性 , 即大 多 数柑 桔 种类 品种 具 有 珠 心 胚 现 象 ’】 近几 十年 来 由于 追 求 无 核性 状 , 致使如今 生 产 中 的 主 栽 品种 大 多 是 雄 性 或 和雌性不育类型 这两个特殊 困难使得柑桔 的有性 杂交工作更难开 展 有性 杂交 , 这 一 在品种改 良和性状遗传规律研究 中的重要途径 , 在柑 桔 育种 中没 能 起到 应 有 的作用 对几 十年来注册 的柑桔品种进行分析也说 明了这一 点 , 柑 桔 品种 有 来 自芽 变 , 即一 种 体 细胞 突变 来 自珠心 苗变异 , 实 际 上 还 是 体细 胞 突变 通 过 有 性 杂交 选 育 出来 的 品 种 占的 比例很小 , 这一育种途 径 的不畅也妨碍 了对柑桔性状遗传规律 的认识 柑桔遗传研 究落后 于 其它农作物 , 因此 , 开创一条 有 效 途 径 , 使柑 桔 不 同种 品种 间实现 基 因重 组 , 一直是柑桔育种者研究 的重 点 年代后 , 植物原 生 质体培 养及 融 合技 术取 得 的成就 为解 决柑桔育种遇到 的珠心胚干扰 , 性器官败育提供 了手段 本研 究 自 年始 , 首 先 建立 柑 桔原生质体再 生技术体系 , 然后 , 建立起 柑 桔 原 生 质体 融 合 及 杂 种 植 株 再 生 技 术体系 最 后 , 对这一技术体系进行改进 , 使之 能应用于育种实践 本文对已 经取得 的结果报道 如下 胚性愈伤组织 的诱导 胚性愈伤组织是进行柑桔 原生质体培养和融合的最佳起始材料 迄今 , 还没有一例关于 胚性 愈伤组织 或悬浮细胞系 之外 的原生质体培养再生 的报道 一 柑桔胚性 愈伤组织一般是 由开花后 一 周 的珠 心 组 织诱 导产 生 昊 金 虎等在 基 本培 养基 上 附加 一 , , 接种 开花后 周 的珠心组织 , 诱导出 个 品种 的胚性愈 伤组织 , 并发现不 同品种 产生 愈伤组 织 的能力 与 该 品种每种子含 珠心胚 的数 目相 关 在 个供试品种 中 , 每种子胚数从多到 少依次为碰柑 、 锦橙 、 桃 叶橙和 本地早 它们产生胚性 愈 伤组 织 的 百 分 比分别 为 , , 和 对于一些 单胚性 种或 品种 , 以及个别 的多 胚 性 种 , 较难 获得 胚性 愈伤组 织 如积 川 她 望辫 一 收稿 , 更阵 , 阵肠 收修改稿 国家 自然科学墓金项 目
36 自然科学进展—一国家重点实验室通讯 第5卷 Ra)、柚子( Citrus grandis Swingle)一直未能得到胚性愈伤组织 获得胚性愈伤组织的另一条途径是从败育的种子中诱导.甘霖等通过这一途径获得了 几个柑桔品种的胚性愈伤组织9.邓秀新等从山金柑( Fortunella hindsii Swingle)试管实生苗 的下胚轴及根部直接获得了胚性愈伤组织0成熟的山金柑种子播种在MT基本培养基中 50d后,有16.7%的幼苗从子叶下0.1~20cm处产生愈伤组织.甚至将子叶下0.5cm处的组 织培养在MT基本培养基上,385%的外植体产生了胚性愈伤组织.这一简易获得胚性愈伤组 织的途径在金柑属的其它种以及柑桔属的一些种均得到证实,只是品种(种)不同,产生的频 率有差异.个别品种,如“脐橙’败育胚珠容易诱导胚状体,而不易获得能继代的胚性愈伤组 织,叶新荣等在培养基中加入AgNO35mg/L,以抑制乙烯产生,获得了该品种的胚性愈伤组 织.通过以上各类途径获得的柑桔类愈伤组织在无外源激素的MT培养基中均能继代保 存,并保持较好的胚胎发生能力.如今,实验室有近20个柑桔种(品种)的胚性愈伤组织,为 以柑桔愈伤组织进行的各类研究提供了方便 不同品种胚性愈伤组织的胚胎发生能力有较大差异.各个品种的愈伤组织的干物质含 量,可溶性蛋白质含量以及脱氢酶活性均与其胚胎发生能力呈正相关.带桔的胚性愈 伤组织干物质含量如果低于10.0%,则再生能力很弱.一般的柑桔胚生愈伤组织干物质含量在 10.0%以上.对胚性愈伤组织胚胎发生的控制一喜足研究的热点. Be1)-ndyyin等1983年发现 以甘油取代培养基中的蔗糖促进了舡伤组织向胚状体方向友展,进一步的研究还发现, 甘油1%~5%取代蔗糖后,虽然促进了胚状体的再生,但对胚状体后期的发育并不有利13.14 由此产生的胚状体在添加麦芽浸出物1500mg/L或硫酸腺嘌呤5mg/L的MT培养基中可进一 步发育,减少畸形压状体比例214 2原生质体培养再生成植株1 柑桔原生质体培养技术首先由vad等报道.16.本研究以我国主栽甜橙( Citrus sinensis Osbeck)品种‘锦橙'胚性愈伤组织为起始材料.采用0.3%的果胶酶和0.3%的纤维素酶离 析愈伤组织,获得原生质体.原生质体经浅层培养方式,在无外源激素的MT基本培养基 中,7d时有4%的细胞恢复分裂.采用低熔点琼脂糖包埋(半固化)可使恢复分裂的原生质 体比例进一步提高到50%.经双层培养,扩大培养面,细胞团可以再生出胚状体.转入摇 床悬浮培养,因改善了培养条件胚状体再生整齐一致,而且再生成植株的时间比固体培养缩 短了1~2个月2.再生植株移栽过程中,适当降低温度至25℃,能有效地减少试管苗的萎 蔫,提高移栽成活率达90%以上12.邓占鏊等利用已建立起的柑桔原生质体再生体系,从 锦橙’桃叶橙'耐盐突变系分离原生质体,经培养再生成植株.耐盐系原生质体在盐“胁 迫”下,存活率和生长都正常,说明耐盐系是稳定的,耐盐系积累较多的脯氨酸,持较高水 平的K+,而吸收较少的C和Na+1.本研究在建立再生体系时,已获得9个种(品种) 的原生质体再生植株(表1) 3原生质体融合与体细胞杂种再生 31已获得的体细胞杂种 Ogawara及 Grosser等应用原生质体融合技术获得了柑桔属间体细胞杂种19-24,这 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
自然科学进展 — 国家重 点实验室通 讯 第 卷 、 袖 子 , 、 诚 一 直未能得 到胚性愈 伤组织 获得胚性 愈伤组织 的另 一条途径是从败育 的种子 中诱 导 甘霖等通过 这一 途 径 获得 了 几个柑桔 品种 的胚性愈伤组织 邓 秀新等从 山金 柑 试管实生 苗 的下 胚轴及根部 直接获得 了胚性愈伤组织 ‘ 成熟 的 山金柑 种子播种在 基本培养 基 中 , 后 , 有 的幼 苗从子 叶下 一 处产生愈伤组织 甚至将子叶下 处的组 织培养在 基本培 养基上 , 的外植体产生 了胚性愈伤组织 这一简易获得胚性愈伤组 织 的途径在 金柑 属 的其它种 以 及柑 桔 属 的一些 种均 得 到证实 , 只 是 品种 种 不同 , 产生的频 率有差异 个别 品种 , 如 ‘ 脐橙 ’ 败育胚珠容 易诱 导胚状体 , 而 不易获得能继代 的胚性愈伤组 织 叶新 荣等在培 养基 中加 人 , 以 抑制 乙 烯产 生 , 获得 了该品种的胚性愈伤组 织 通过 以上 各类 途 径获得 的柑桔 类 愈 伤组 织 在 无 外 源激 素 的 培 养 基 中均 能 继 代 保 存 , 并保持较好的胚胎发生能力 如今 , 实验 室有 近 个柑桔 种 品种 的胚性 愈伤组织 , 为 以柑桔 愈伤组织进行 的各类研究提供 了方便 不 同品种胚性 愈伤组织 的胚胎发 生 能力有 较 大 差 异 各 个 品 种 的 愈 伤组 织 的 干物 质含 量 , 可溶性蛋 白质含量 ” 以及 脱氢酶 括性 均 与其 胚 胎 发 生 能 力 呈 正 相 关 柑 桔 的 胚 性 愈 伤组织 干物质含 量 如果低于 , 则 再 生能力很弱 一般的柑桔胚性愈伤组织干物质含量在 以 上 对胚性愈 伤组 织胚胎 发生 的控制一直是研究 的热点 一 等 年发现 以 甘 油取 代 培 养 基 中 的 蔗 糖 促 进 了 愈 伤 组 织 向胚 状 体方 向发 展 , 进 一 步 的研 究 还 发现 , 甘油 一 取代蔗糖后 , 虽然促 进 了胚状体的再生 , 但对胚状体后期的发育并不有利“ , ‘ 由此 产生 的胚状体在添加 麦芽浸出物 或硫酸腺嗓 吟 的 培养基 中可 进一 步 发育 , 减 少畸形胚状体 比例 , , 原 生质体培养再生成植株 ‘, ’ 柑 桔 原生质体培 养技术首先 由 等报道 , ’“ 本研究 以 我 国主栽甜橙 。 品种 ‘ 锦橙 ’ 胚性 愈伤组织 为起 始材 料 采 用 的果 胶 酶 和 的纤 维 素酶 离 析愈伤组织 , 获得原 生质体 原生质体经 浅层 培 养 方 式 , 在 无 外 源 激 素 的 基 本 培 养基 中 , 时有 的细胞恢复分 裂 采用低 熔 点琼脂糖包埋 半 固化 可 使恢 复分裂 的原生 质 体 比例进一步提 高到 经双层培 养 , 扩大 培 养 面 , 细 胞 团 可 以 再 生 出胚 状 体 转人 摇 床悬 浮培 养 , 因改善 了培 养条件胚状体再 生整 齐一致 , 而且再 生成 植株 的时 间 比固体培养缩 短 了 一 个月【’ 再 生 植株移栽过程 中 , 适 当降低温度 至 ℃ , 能有 效地 减少试管苗的萎 蔫 , 提 高移栽成 活 率达 以 上【‘ 邓 占鳌等利 用 已 建 立起 的柑桔 原 生 质 体 再 生 体 系 , 从 ‘ 锦橙 ’ 、 ‘ 桃 叶橙 ’耐盐突变 系分 离原生 质体 , 经培养再生成植株 耐 盐 系 原 生 质 体在 盐 “ 胁 迫 ” 下 , 存活率和 生长都正 常 , 说明耐盐 系是稳定 的 , 耐盐系积累较多 的脯 氨 酸 , 持较高水 平 的 , 而 吸收较少 的 一 和 ’, ’ 本研究 在 建 立 再 生 体 系 时 , 已 获 得 个 种 品种 的原 生质体再生 植株 表 原生质体融合与体细胞杂种再生 已获得的体细胞杂种 及 等应 用原生质 体融 合技 术 获得 了柑桔 属 间体细胞杂种【‘”一 ’ 这 一
第1期 邓秀新等:柑桔原生质体培养与融合研究 表1原生质体再生植株的柑桔种类 起始材料 作者和年份 甜橙C. sInensIs 锦橙 性愈伤 邓秀新等,1988 胚性愈伤 邓占鳌等,1989 朋娜’脐橙 胚状体子叶 叶新荣等,1993 伏令夏 悬浮系 等,1993 宽皮桔C. redial ta 胚性愈伤 胚性愈伤 邓秀新等,1988 柠橡C. [imon 性愈伤 甘等,1993 桔橙杂种 悬浮系 甘霖等,1993 C. sinensis Fortunella hindsii 性愈伤 邓秀等,1989 技术克服了性器官败育的障碍, Kobayashi等获得了耱性败育的温州蜜钳(C. unshiu)与雌雄 性器官均败育的脐橙(C. sinensis,种间体细胞杂种25. Grosser等实现了柑桔属( Citrus)与 有性不亲和的近缘非洲樱饼桔( Catopsis)和蠊壳刺属( severinia)的融合,首次获得属间 杂种21.23,展示了这一技术的巨大潜力 本研究采用粲乙二醇(PEG)诱导融合方法,将一个亲本的悬浮细胞系或胚性愈伤组织的 原生质体与另一个亲本的叶肉原生质体融合,经浅层双层-固体培养体系再生成植株(表2 列出了本研究获得的柑桔体细胞杂种).该融合技术体系利用叶肉一方在所用的培养条件下 无法再生这一特点作为选择条件,所以再生植株中有几种类型,即体细胞杂种,胚性亲本以 及胚性亲本自发融合类型.再生植株必须经过遗传鉴定方可确定,本研究主要采用叶片形态, 染色体数目以及多种同工酶等指标,.柑桔种属间叶片形态差异较大,如枳( Poncirus trifolia) 具三出复叶.这一性状为显性遗传.因此,以其为亲本的融合组合再生植株中,如某植株具 有三叶性状,就可初步认为含有枳的基因.在宜昌橙(C. ichangensis)与伏令夏甜橙的融合 组合中,宜昌橙翼叶较大,后代很容易识别920.26.同工酶分析经济方便,绝大多数同工 酶表现十分稳定,已广泛应用于柑桔体细胞杂种的鉴别中 通过原生质体融合技术,经以上三项指标鉴定,日前已得到2个柑桔属间及5个种间体 细胞杂种(见表2).这些组合并非是随意地选择的,如金柑与甜橙属间融合希望将金柑的抗 寒性以及一年多次开花的特性转移到不耐寒的优良甜橙品种中去.本结果也是首次实现柑桔 类植物果实经济价值最大的二属间的融合 32体细胞杂种再生 32.1基因型的影响 基因型对融合体再生能力有明显的影响.对目前世界上60多个柑桔种间及属间体细胞 杂种亲本组成分析,发现有55%的组合含有甜橙(C. sinensis)这个种.为进一步分析这,同 题,本研究在同一条件下进行了不同基因型对融合体再生影响的试验.结果表明,不管是作 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.aLlrightsreservedhttp://www.cnki.net
第 期 邓秀新等 柑桔原生质体培养 与融合研究 表 原生质体再生植株的柑枯种类 】 起始材料 作者和年份 附溯 种类或品种 甜橙 泣”印 台 ‘ 锦橙 ’ ‘ 桃 叶橙 ’ ‘ 朋娜 ’ 脐橙 ‘ 伏令夏 ’ 宽皮枯 耐口 。 ‘ 本地早 ’ ‘ 碰柑 ’ 柠檬 如 桔橙杂种 以 硕侧 止陀即 山金柑 几对 陀 胚性愈伤 胚性愈伤 胚状体子叶 悬浮 系 邓秀新等 , 邓 占获等 , 叶新荣等 , 甘 霖等 , 胚性愈伤 胚性愈伤 胚性愈伤 邓 秀新等 , 邓秀新等 , 甘 霖等 , 悬浮系 甘 霖等 , 卯 胚性愈伤 邓 秀新等 , 兜 技术 克服 了性器官败育 的障碍 , 等获得 了雄性败育 的温 州蜜柑 溯 与雌 雄 性 器官均败育的脐橙 、 的种 间体细胞杂种 等实 现 了柑 桔 属 、, 与 有性不 亲和 的近缘植物非洲樱桃桔 和 赚壳刺属 的融 合 , 首 次 获得 属 间 杂种 , , 展示 了这一技术 的巨大潜力 本研究 采用 聚乙 二醇 诱导融合方法 , 将一个亲本的悬浮细胞系或胚性愈伤组织的 原生质体与另 一个亲本的叶 肉原生质体融合 , 经浅层 一 双层 一 固体培养体系再 生成植株 表 列 出了本研究 获得的柑桔体细胞杂种 该融合技术体系利用叶肉一 方 在 所 用 的培 养条件 下 无法再生这 一特点作为选择条件 , 所 以再生植株 中有几种类型 , 即体细胞杂种 , 胚性 亲本以 及胚性亲本 自发融合类型 再生植株必须经过遗传鉴定方可 确定 本研究 主要采用叶片 形态 , 染 色 体数 目以 及 多 种 同工 酶 等指 标 柑桔种属间叶片形态差异较大 如积 、 具 三 出复 叶 这 一性状为显性 遗传 因此 , 以其为亲本的融合组合再生植株 中 , 如某植株具 有 三 叶性状 , 就可初步认为含有积 的基 因 在 宜 昌橙 与伏令 夏 甜 橙 的融 合 组合 中 , 宜 昌橙翼 叶较大 , 后代很容易识别【’, , 同工 酶 分 析 经 济方 便 , 绝大 多数 同工 酶表现 十分稳定 , 已广泛应用 于柑桔体细胞杂种 的鉴别 中 通过原生质体融合技术 , 经 以上三项指标鉴定 , 目前 已得 到 个柑桔属 间及 个种 间体 细胞杂种 见表 这些组合并非是 随意地 选择的 , 如金柑与甜橙属 间融合希望将金柑 的抗 寒性 以及一年多次开花 的特性转移到不耐寒的优 良甜橙 品种 中去 本结果 也是首次实现柑桔 类植物果实经济价值最大的二 属 间的融合 体细胞杂种再生 基因型 的影 响 基 因型 对融合体再生能力有 明显 的影 响 对 目前世界 上 多 个 柑 桔 种 间及 属 间体细 胞 杂种亲本组成分 析 , 发现有 的组合含有甜橙 认 这个种 为进一步分析这 下 问 题 , 本研究在 同一条件下进行 了不 同基 因型对融合体再生影 响的试验 结果表 明 , 不管是作
自然科学进展—国家重点实验室通讯 第5卷 表2本项目育出的柑桔体细胞杂种 作者及年份 1.‘伏令夏橙+‘宁波金柑 邓秀新等 Citrus sinensis+ Fortunella crassi 令夏'橙+宜昌 3.·哈姆林’甜橙+粗柠檬 邓秀新等, 朋娜'脐橙+·红桔 叶新荣等,19 5.·锦橙'+·红桔 邓秀新等,1993 C. sinensis+C, reticulata 6·红桔’+柠槨 甘等 1993 C. reticulata +C. limon 7.柠槺+枳橙 甘霖等,19 C. limon+(C. sinensis x Poncirus trifoliata) 为叶肉原生质体亲本,还是作为胚性愈伤组织(悬浮系)原生质体杀本,衎檬、甜橙以及桔 橙杂种为亲本的组合再生较容易一些.这些稗(种}从一些遗传研兖结果来看,均是杂种 起源起源上越近的种类,其再主能力越强,而一些古老品种,如红桔则再生困难.这 结果在柑桔的器官培养中同桦也观察到 322再生过程中的染色体变异l 对融合体再生过程中染色体数目的观察发现,一些再生十分困难的组合,如脐橙与红 桔,胚状体中有近20%为非整倍体,还观察到个别融合体细胞分裂不同步现象,再生困难 主要与此有关.柑桔属与亲缘关系较远的近缘植物黄皮( Clausena)融合再生出的植株为三 倍体4,而其亲本均为二倍体.在粗柠檬与甜橙的融合再生植株中观察到叶肉亲本类型,同 工酶检测表明它含有另一亲本的个别带、而染色体数为二倍体2n=2x=1827.这些事实说 明柑桔远缘的属间,甚至个别亲缘关系很近的种间,存在或多或少的不协调,至少植株再生 以前是这样.对已获得的一批体细胞杂种的植株形态、生长情况的连续观察表明,体细胞杂 种性状稳定,均为异源四倍体2n=4x=36,同工酶为双亲酶带的合141.20.26 32.3植株再生过程中的困难 相对未融合的细胞而言,融合体再生较难一些,主要表现在融合后再生的畸形胚状体的 比例较高.这些胚状体无法直接萌发,而必须经过器官发生途径,即先诱导不定芽,然后, 再生根成为完整植株.个别含有野生种的组合,如·伏令夏'橙与宜昌橙种间融合,再生的不 定芽在所试验的条件下均不生根;本研究采用试管微嫁接方法,终于获得该组合的一批体细 胞杂种植株26 33体细胞杂种的竞争优势 在所进行的一些融合组合中,如‘伏令夏'甜橙与·宁波'金柑属间,“哈姆林’甜橙与粗 柠檬种间等,体细胞杂种再生的频率很高,达67%.在一个半选择培养条件下,异源四 倍体体细胞杂种与二倍体相比表现出一定优势.不少组合,再生的第一株植株是体细胞杂 种9.20.2也说明了这一点 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnkinet
自然科学进展 — 国 家重点 实脸室 通 讯 第 卷 表 本项 目育出的柑桔体细 胞杂种 组 合 卿叨哟粥 ‘ 伏令夏 ’ 橙 ‘ 宁波金柑 ’ ‘川 印 ‘ 不 泣 ‘ 伏令夏 ’橙 十 宜 昌橙 ”川 招 泣改 曰 站 ‘ 哈姆林 ’甜橙 十 粗柠檬 泣即 妇 厄 ‘ 朋娜 ’脐橙 ‘ 红桔 ’ 坛”印 臼 了 玄山 ‘ 锦橙 ’ 十 ‘ 红桔 ’ 翻 拈 邝亡止印 一 红桔 ’ 柠檬 戒应侧 溯 。 柠檬 积橙 俪朋 月印 阴 八乙 作者及年份 邓秀新等 , 邓秀新 等 , 邓秀新等 , 叶新荣等 , 邓秀新 等 , 霖等 , 霖等 , 为叶 肉原生质体亲本 , 还是 作 为胚性 愈 伤 组 织 悬 浮 系 原 生 质 体 亲 本 , 柠 檬 、 甜 橙 以 及 桔 橙 杂种 为亲本 的组合再生较容易 一些 这 些 种 品 种 从 一 些 遗 传研究 结 果 来 看 , 均 是 杂种 起 源 起源上越 近 的种类 , 其再生能力越强 , 而一些 古 老 品种 , 如红 桔 则 再 生 困难 这 一 结果在柑桔 的器官培 养 中同样也观察到 , 再生过程 中的染色体变异 川 对融合体再 生过程 中染 色体数 目的观 察 发 现 , 一 些 再 生 十 分 困难 的 组 合 , 如 脐橙 与红 桔 胚状体 中有 近 为非 整倍体 , 还观 察到个别融合体细 胞分 裂 不 同步 现 象 , 再 生 困 难 主要 与此有关【川 柑桔属 与亲缘 关 系较远 的近缘植物黄皮 融 合再 生 出的植株 为三 倍体 ’ , 而其亲本均 为二倍体 在粗柠檬 与甜橙 的融合再生 植株 中观 察到 叶 肉亲本类 型 , 同 工 酶检测表 明它含有 另 一 亲本 的个别 带 、 而 染 色 体 数 为二 倍体 二 , 这 些 事 实说 明柑桔 远缘 的属 间 , 甚 至 个别 亲缘关系很近 的种 间 , 存在 或 多或少 的不 协调 , 至 少植株再生 以前是 这样 对已 获得 的一批体细胞 杂种 的植株形 态 、 生 长情况 的连续观 察表明 , 体细胞杂 种性状稳定 , 均 为异 源 四倍体 一 一 , 同工酶 为双亲酶带的合 , , , , 植株再生过程 中的困难 相 对未融合的细胞而 言 , 融 合体再生较难 一些 , 主要 表 现在融合后再 生的畸形胚状体 的 比例较高 这些胚状体无法直接萌发 , 而必须经过器官发生途 径 , 即先诱导不定 芽 , 然后 , 再生根成 为完整植株 ’ 个别含有野生种的组合 , 如 ‘ 伏令夏 ’橙与宜 昌橙种间融合 , 再 生 的不 定芽在所试验 的条件下 均 不 生根 本研究采 用试管微嫁接方法 , 终于 获得该组合的一批 体细 胞杂种植株 , 体细胞杂种 的竞争优势 在所进行 的一些融合组 合 中 , 如 ‘ 伏令夏 ’ 甜橙 与 ‘ 宁 波 ’ 金 柑 属 间 , ‘ 哈 姆 林 ’ 甜橙 与粗 柠檬种 间等 , 体细胞杂种再生 的频率很 高 , 达 【 在 一 个半 选 择培 养 条件 下 , 异 源 四 倍体体细胞杂种 与二倍体相 比表现 出一 定 优 势 不 少 组 合 , 再 生 的第 一 株 植 株 是 体细 胞 杂 种 , , 旬 也说 明了这一点
第1期 邓秀新等:柑桔原生质体培养与融合研究 34再生植株中出现叶肉类型植株 目前,尚未见柑桔叶肉原生质体单独培养再生的报道.但是,在一些融合组合中发现了 叶肉类型植株12,28.是因为融合的作用,还是另一方的饲喂作用或者是融合体丢失了另一 方的部分(或全部)染色体后再生,有待进一步研究.粗柠檬、酸橙叶肉原生质体单独培 养,曾观察到1~2次分裂,但后来停止生长 3.5体细胞杂种的农艺性状与育性 3.51生长特性及抗性 所获得的几个体细胞杂种植株,有3个已移入大田,表现出四倍体的一些特点,如叶片 较二倍体厚,刺较长、粗,枝条粗壮,同一组合再生出的体细胞杂种之间,叶片和枝梢生长 习性未发现有明显的变异.采用电导法及膜脂肪酸组分分析法,对3个体细胞杂种的抗寒性 进行测定,结果显示,柑桔体细胞杂种的抗寒性介于双亲之间,如金柑与甜橙的体细胞杂种可 耐-9.5℃,而其亲本分别耐-100℃C和-78℃.1993年11月底武汉地区骤然降温,植株未 完全进入耐寒状态,粗柠檬叶片受冻,785%的叶片脱落,而它与抗寒性较强的甜橙的体细胞 杂种落叶率为489%,同条件下的甜橙落叶率为30.4%.同园内:余彬以及金柑与甜橙的体 细胞杂种无落叶,说明原生质体融合途径在培育抗寒祜类型中具有潜在外值 352体细胞杂种的育性1-3 原生质体融合而来的一年生作物的体细胞杂种均存在不育问题3.迄今,已有几例柑桔 体细胞杂种开花结杲的遐道.墨西哥'来檬与‘伏令夏”甜橙种间体细胞杂种表现出可育 年的测定轰踢,其沌粉育性稳定,达到38%~52%,平均每果有6粒左右的种子,枳与甜 橙的属间体细胞杂种花粉育性达到90%,接近高值亲本枳(91%).体细胞杂种植株花粉粒比 亲本大,体积为双亲花粉体积之和.这类异源四倍体植株,由于染色体的互补作用,使原 来亲本的一些不正常现象消失了,如染色体易位突变体伏令夏’甜橙与染色体倒位突变体墨 西哥’'来檬融合之后,杂种的每果种子数比双亲增多,胚囊/花粉均败育的脐橙与枳橙属间 体细胞杂种,也有类似现象,体细胞杂种克服了脐橙的不育性 4问题与展望 41体细胞杂种的倍性问题及解决方法 采用目前的对称融合技术,获得的绝大多数是一个对称杂种.人们在希望获得2个优良 性状重组的同时,尚不能阻止不良性状的进入.正因为如此,在过去的20年中,体细胞对 称融合技术未能有效地应用于育种实践.目前柑桔栽培的品种以二倍体为主,其次是三倍 体,体细胞融合虽然克服了有性杂交中遇到的珠心胚干扰和性器官败育问题,但是,得到的 是一个四倍体,作为接穗品种应用可能会有局限性,针对这一问题可采取下列措施 41.1作为砧木应用 柑桔同其它果树一样,生产中应用的个体是由地上(接穗)和地下(砧木)两部分构成的一 个复合体.人们往往通过釆用理想的砧木来提高地上部分的抗病虫及抗逆能力,而对砧木 本身的果实品质、产量考虑很少,因此,体细胞杂种作为砧木应用将会有很大的潜力,目前 本项目也正在进行这一方面的工作. Grosser等(199,私人通信)的研究表明,枳与甜橙的 体细胞杂种作为砧木,嫁接优良品种伏令夏'甜橙,第二年平均每株挂果20余个,植株表 201994-2008chinaAcademicJournaleLectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
第 期 邓秀新等 柑桔原生质体培养 与融合研究 再生植株中出现叶 肉类型植株 目前 , 尚未见柑桔 叶肉原生质体单独培养再生的报道 但是 , 在一些融合组合 中发现 了 叶肉类 型植株【, 是 因为融合的作用 , 还是另 一方 的饲喂作用 或 者是 融 合体丢失 了另 一 方 的部 分 或 全部 染 色体后 再 生 , 有 待 进 一 步 研 究 粗 柠檬 、 酸 橙 叶 肉原 生 质 体 单独 培 养 , 曾观 察到 一 次分裂 , 但后来停止 生长 体细胞杂种的农艺性状与育性 生长特性及抗性 所获得 的几个体细胞杂种植株 , 有 个 已 移人 大 田 , 表 现 出四 倍体的一些 特点 , 如 叶片 较 二倍体厚 , 刺较 长 、 粗 , 枝 条粗 壮 同一组 合再生 出的体细胞杂种之 间 , 叶片和枝梢生长 习性 未发现有 明显 的变异 采用 电导法 及膜脂肪酸组分分析法 , 对 个体细胞杂种 的抗 寒性 进行测定 , 结果显示 , 柑桔体细胞杂种的抗寒性介于双亲之间 如金柑与甜橙的体细胞杂种可 耐 一 ℃ , 而其亲本分别耐 一 ℃ 和 一 ℃ 年 朋 底武汉地 区骤然 降温 , 植株 未 完全进入耐寒状态 , 粗柠檬叶片受冻 , 的叶片脱落 , 而它与抗寒性较强的甜橙的体细胞 杂种落叶率为 , 同条件下 的甜橙落 叶率为 同一 园 内 , 金柑 以 及金柑 与甜橙 的体 细胞杂种无落叶 , 说明 原生质体融合途 径在培 育抗寒柑桔类型 中具有潜在 价值 体细胞杂种 的育性 一 川 原生质体融合而来 的一 年生作物 的体细胞杂种均存在不育 问题 迄今 , 已有几例柑桔 体细胞杂种开花结果 的报道 ‘ 墨西哥 ’ 来檬 与 ‘ 伏令夏 ’ 甜橙种间体细 胞 杂种 表 现 出 可育 刃 , 几 年的测定表 明 , 其花粉育性稳定 , 达到 一 , 平均每果有 粒左右 的种子 , 积 与甜 橙 的属 间体细胞杂种花粉育性 达到 , 接近高值亲本积 体细胞杂种植株花粉粒 比 亲本大 , 体积 为双亲花粉体积之 和艺 这类异源四倍体植株 , 由于染色体的互补作用 , 使原 来亲本 的一些不正 常现象消失 了 , 如染 色体易位突变体 ‘ 伏令夏 ’甜橙与染色体倒位突变体 ‘ 墨 西哥 ’ 来檬融合之后 , 杂种 的每果种子数 比双亲增 多 , 胚囊 花粉 均 败 育 的脐橙 与积橙 属 间 体细胞杂种 , 也有类似现象 , 体细胞杂种克服 了脐橙 的不 育性 ‘】 问题与展望 体细胞杂种的倍性问题及解决方法 采 用 目前 的对称融 合技术 , 获得 的绝大多数是一个对称杂种 人们在希望获得 个优 良 性状重组 的同时 , 尚不 能阻止不 良性状 的进入 正 因为如此 , 在 过 去 的 年 中 , 体细 胞对 称融合技术未能有效地 应用于育种 实践 目前柑桔栽 培 的 品种 以二倍 体 为 主 , 其次是 三倍 体 , 体细胞融合虽然克服 了有性杂交 中遇到 的珠心胚干扰和性器官败育问题 , 但是 , 得到的 是一 个 四倍体 , 作为接穗品种应用可能会有局 限性 , 针对这一 问题 可采取下列措施 作为砧木应用 柑桔 同其它果树一样 , 生产中应用 的个体是 由地上 接穗 和地下 砧木 两部分构成 的一 个复合体 人们往往通过采用理 想 的砧 木 来提 高地 上部 分 的抗 病 虫及 抗 逆 能 力 , 而 对砧木 本身的果 实 品质 、 产量 考虑很少 因此 , 体细胞杂种作为砧木应用将会有很大的潜力 , 目前 , 本项 目也正 在进行这一方面的工作 等 , 私人 通 信 的研究 表 明 , 积 与甜橙的 体细胞 杂种作为砧木 , 嫁接优 良品种 ‘ 伏令夏 ’ 甜橙 , 第二年平均每 株挂 果 余个 , 植株 表
自然科学进展——国家重点实验室通讯 第5卷 现矮化,未表现不亲和现象.本项目已进行的大多数融合组合都是针对砧木方向选配的 412体配融合一步获得三倍体无核柑桔类型 早在本研究开始,就注意到了这一方面.邓秀新等1990年已从柑桔的四分体小孢子中 分离出单倍体原生质体.将柚子的四分体单倍体原生质体与甜橙二倍体原生质体融合, 已再生出三倍体胚状体.并在这种体配融合后的原生质体培养过程中,首次观察到花粉管生 长和分裂现象;这说明控制花粉管生长的基因在四分体时期已转录或者表达.目前,已开展 多个组合的体配融合研究,其中甜橙与枳的体配融合已再生出植株,待进一步作遗传鉴定.获 得三倍体柑桔类型.三倍体柑桔大、无籽,是过去几十年柑桔育种者一直追求的目标之一 41.3不对称融合转移部分基因 vardi等采用了不对称融合体系,即将一方的原生质体用射线处理使其核失活;另一方, 采用代谢抑制剂碘乙酸处理,使胞质失活,再融合,获得了一批胞质杂种,染色体倍性不增 加而又达到了转移一些基因的目的3.本研究正在建立使双方原生质体失活的技术体系 4.1.4体细胞杂种作为一种桥粱,可使野生种的一些有利基因向裁培品种转移 目前已建立起的融合技术类似一座“桥梁”,它使一些不亲和,有性杂交有疃碍的两种 (属)间实现基因重组成为可能,花粉育性测定结果显示,榭枯体细胞杂种逯可育的,可作 为杂交亲本利用.实际上 Gmitter等(1993,私人逅信)已体细胞杂种的花粉与单胚性柑桔 品种杂交,得到了三倍体后代,植滦表现出野生种亲亦的菜些特征 4.2展望 植物原生质体融合技术首先在烟草上获得成功.经过20年的发展,正如许多人预料的 那样,首先应用的将是在无性繁殖的木本植物中,果树大多属于这一类植物.细胞融合获得 的优良个体,可通过无性方法繁殖成为无性系品种,获得“一劳永逸”的作用,而一些大田作 物往往因不育而不能保存,应用生产则更困难 参考文 I Soost R K, Cameron J w. Citrus, In: Janick J and Moore I N, eds. Advance in Fruit Breeding, Purdue Uni Press, West Lafayette, Indiana. 1975, 507-540 2 Mendel K. Bud mutation in citrus and their potential commercial value. Proc Int Soc Citriculture Tokyo), 1981 86~89 3邓秀新,章文才,柑桔原生质体融合及遗传转化的研究进展.果树科学,1991,8(1):51~58 J w, Gmitter Jr F G. Protoplast fusion and citrus improvement. Plant Breed Rev, 1990, 8: 339-374 A, Spiegel-Roy P, Galun E. Plant regeneration from citrus protoplasts: variability in methodological requirements among cultivars and species. Theor Appl Genet, 1982, 62: 171-176 6吴金虎,陈吉笙,章文才等,柑桔胚珠培养及胚状体发生的研究.果树科学,199,71):19~24 7 Murashige T, Tuoker D P H. Growth factor requirements of citrus tissue culture. Proc lst Int. Citrus Congress 8 Gmitter F G Jr. Moore G A. Plant regeneration from undeveloped ovules and embryogenic calli of citrus. Plant Cell Tiss Org Cult, 1990, 6: 139-147 9甘幂,章文才,邓秀新.从败育种子诱导柑桔的胚性愈伤组织,华中农业大学学报,1993,125490~42 10邓秀新,章文才,从山金柑试管实生苗直接诱导胚性愈伤组织的研究.中国柑桔,198,174):7~9 l1叶新荣,邓秀新,肖顺元等,柑桔种间原生质体融合植株再生及染色体数目变异的研究.实验生物学报,1993,26(1) 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.aLlrightsreservedhttp://www.cnkinet
自然科学 进展 — 国家重 点 实验室通 讯 第 卷 现矮 化 , 未表现不 亲和 现象 本项 目已进行 的 大 多 数 融 合 组 合 都 是 针 对砧 木 方 向选配 的 体配融合一步获得三倍体无 核柑桔类型 早在本研究 开始 , 就注意到 了这一方 面 邓 秀新 等 年 已 从柑 桔 的 四 分 体小 抱 子 中 分 离出单倍体原生质体 】 将袖子 的 四分体单倍 体原 生质 体 与 甜 橙二 倍体原 生 质体融 合 , 已 再生 出三倍体胚状体 并在这种体配融合后 的原生质体培养过程 中 , 首次观察到 花粉管生 长和分裂现象 这说明控制花粉管生长的基 因在 四 分体时期 已转录或者表达 目前 , 已 开展 多个组合 的体配融合研究 , 其 中甜橙 与积的体配融合已再生出植株 , 待进一步作遗传鉴定 获 得 三 倍 体柑 桔 类 型 三倍体柑桔大 、 无籽 , 是过去几十年柑桔育种者一直追 求的 目标之一【 不对称融合转移部分基因 等采用 了不 对称融合体系 , 即将一方的原生质体用射线处理使其核失活 另一方 , 采用代谢抑制剂碘 乙 酸处理 , 使胞质失活 , 再融合 , 获得 了一批胞质杂种 , 染 色体倍性不增 加而又达到 了转移 一些基 因 的 目的 本研究 正 在 建 立 使 双 方 原 生质 体失 活 的技 术体系 体细胞杂种作为一种桥梁 , 可使野生 种的一些有利基因向栽培品种转移 目前 已 建 立起 的融合技 术类似 一 座 “ 桥 梁 ” , 它 使 一 些 不 亲 和 , 有性 杂 交 有 障碍 的 两 种 属 间实现基 因重 组成 为可能 花粉育性测 定 结 果 显示 , 柑桔体 细 胞杂 种 是 可 育 的 , 可 作 为杂交亲本利用 实 际上 而 等 , 私人通信 已 用 体细胞杂种 的花粉 与单胚性 柑 桔 品种 杂交 , 得到 了三倍体后 代 , 植株表现 出野生种亲本 的某些 特征 展望 植物原生质体融合技术首先在烟 草上获得成功 经过 年 的发 展 , 正 如 许多 人 预料 的 那样 , 首先应用 的将是在无性 繁殖 的木本植物 中 果树大 多属于这一类 植物 细胞融合获得 的优 良个体 , 可通过 无性方法繁殖成为无性 系 品种 , 获得 “ 一 劳永逸 ” 的作用 而 一些大 田作 物往往 因不育而 不 能保存 , 应用生产则更 困难 , 参 考 文 献 , 叭 阴 , 」自司 , 七 玫 界 , 川 , 印 一 喇 胡 , , 喝 坦 比 邝 理 汀 扣 , , 邓 秀新 , 章文才 柑枯原生质体融合及遗传转化的研究进展 果树科学 , 叨 , 厌 一 , 仙 仍 , 少〕 , 一 , 罗 · , 习 罗拙 阴 过 们。 明 此 七 胎 , , 吴 金虎 , 陈吉笙 , 章文才等 柑枯胚珠培养及胚状体发生 的研究 果树科学 , 蜘 , 一 比 ‘ 罗 , 因 哩 阴 钊 , , 一 打 , 罗 助 巴 卯罗 刀 谓 , 哭刃 , 一 甘霖 , 章文才 , 邓秀 新 从败 育种子 诱导柑桔 的胚性 愈伤组织 华 中农业大学学报 , 卯 , 双牙月如 一 心 邓 秀新 , 章文 才 从 山 金柑 试管 实生 苗直接诱导胚性 愈伤组 织的研究 中 国柑桔 , , 一 叶新荣 , 邓秀 新 , 肖顺元等 柑桔 种 间原生质体融 合植株再生 及 染色体数 目变 异 的研 究 实验生物学报 , 卯 , 斌
第I期 邓秀新等:柑枯原生质体培养与融合研究 41 2邓秀新,章文才,万蜀渊.柑桔原生质体分离及再生植株研究,园艺学报,1988,15(2):99~102 13邓占鳌,章文才,万蜀渊.诱发柑珠心愈伤组织质其原生质体细胞胚胎发生与植株再生.实验生物学报,190, 23(2):l35~143 14邓占,章文才,万蜀渊,.诱发柑桔“适应型珠心愈伤组织体细胞胚胎发生的研究,果树科学,1991,84:193~200 15邓秀新,邓占,章文才,锦橙及山金柑胚性意伤组织诱导及原生质体再生成株,农学通报,1989,(3):13~15 16 Vardi A, Spiegel-Roy P, Galun E. Citrus cell culture: isolation of protoplast, plating density, effect of mutagens and bryos. Plant Sci Lett, 1975, 4: 231 I7邓占鳌,章文才,万蜀渊.柑植耐盐系的离体诱发与原生质体植株再生,园艺学报,193,202:127~132 18邓占,邓秀新,章文才等、柑桔原生质体抗盐突变体诱发、培养和分高纯化研究,果树科学,1989.62):143~146 19邓秀新, Grosser w, Gmitter FG Jr.原生质体融合获得柑桔种间体细胞杂种.遗传学报,1992,192):140~144 20 Dengx X, Grosser J W, Gmitter F G Jr. Intergeneric somatic hybrid plants from protoplast fusion of kumquat (Fortune 21 Grosser J W, gmitter F G Jr et al. Intergeneric somatic hybrid plants of citrus sinensis and severenia disticha Theor. Appl Genet, 1988, 75: 397-40 22 Grosser J, w, Gmitter F G Jr, Chandler J L. Intergeneric somatic hybrid plants of citrus sinensis cv, Hamlin and Poncirus trifoliata cv. Flying Dragon. Plant Cell Reports, 1988, 7: 5-8 23 Grosser J W, Gmitter F G Jr, Tusa H et al. Somatic hybrid plants from sexual incompatible woody species Citrus reticulata and Citropsis gilletiana. Plant Cell Reports, 3990, 8: 636-659 24 Ohgawara T, Kobayashi S, Ohgawara E et a. Somatic hybrid pints obtained by protoplast fusion between citrus 25 Kobayashi S, Ohgawara T, Ohgawera t. et al. A soma t c hybrid pi ant obtained by protoplast fus ion between navel range(Citrus sinensi;and saisum Ia narin (C. .nsiuiu). Plant Cell Tiss Org Cult, 1988, 14: 63-69 26邓秀新,顺 宜怪橙与状令夏橙种间体细胞杂种,生物工程学报 27邓秀新,肖颧元,章文才等,原生质体融合再生叶肉亲本类型植株,中国柑桔,1993,22):8~10 28 Tusa N, G:osser J W, gmitter F G Jr. Plant regeneration of 'Valenoia'Sweet orange, ' Femminello'lemon and heir interspecific somatic hybrid following protoplast fusion. J Am Soc Hort Sci, 1990, 115: 143-146 29邓秀新, Grosser J w, mitter F G.西哥来檬与伏令夏橙种间体细胞杂种的育性研究,遗传,1992,(1):7~8,30 30 Kabayashi S, Oiyama T, Yoshinaga K. Fertility in an intergeneric somatic hybrid plant of rutaceae. Hort Sci, 1991 262):207 31 Ohgawara T, Kobayashi S. Ishii S et al. Fertile fruit tree obtained by somatic hybridization: Navel orange(Citrus sinensis)and Troyer oitrange(C. sinensis x Poncirus trifoliata). Theor Appl Genet, 1991, 31: 141- 143 32 Harms C T. Somatic incompatibility in the development of higher plant somatic hybrids. Quart Rev Bio, 1983. $8 33邓秀新,章文才,柑桔小孢子原生质体的分离,中国柑桔,1990,191):7~8 34邓秀新,章文才.柑桔染色体倍性操纵与育种.果树科学,1993,10(增刊):2~28 35 Vardi A, Breiman A, Galun E. Citrus cybrids: production by donor-recipient protoplast-fusion and verification by mitochondrial DNA restriction profiles. Theor Appl Genet, 1987, 75: 51-58 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.aLlrightsreservedhttp://www.cnki.net
第 期 邓秀新等 柑桔原生质体培养与融合研究 邓 秀新 , 章文才 , 万 蜀渊 柑桔 原生质体分 离及再生植 株研究 园 艺学报 , , 术 一 邓 占鳌 , 章文才 , 万 蜀 渊 诱发 柑枯珠心 愈伤组织质其原生质体细 胞胚胎发生 与 植 株再 生 实 脸 生 物学 报 , 男 , 一 拼 邓 占盆 , 章文才 , 万 蜀 渊 诱发柑拮 “ 适应型 ’ 珠心 愈伤组织体细胞胚胎发生的研究 果树科学 , 卯 , 城 一 姗 巧 邓 秀新 , 邓 占鳌 , 章文才 锦橙及 山金柑胚性愈伤组织诱导及 原生 质体再生成株 农学通报 , , 一 , 罗 一 , 目 朋 , 扒 以叫罗璐 叻 子茂 】 此 , , 一 邓 占鳌 , 章文才 , 万蜀 渊 柑桔耐盐 系的离体诱发与原生质体植株再生 园艺学报 , 卿 , 洲 一 邓 占获 , 邓 秀新 , 章文才等 柑桔原 生质体抗盐突变休诱发 、 培养和分离纯化研究 果树科学 , , 《 一 邓 秀新 , 姗 · , 肠 , 原生质体融合获得柑枯种间体细胞杂种 遗传学报 , 卯 , 气 钓一 众 , , 五 罗淤 以 仙 睐 ‘ ’ 初 刊梦 朋 拙 ‘ 解该 ’ , 望趁 , 心 , 罗讹 阴 沁璐 比 配 , 男 , 一 钓 , , , 介山 罗 谓 配 区 留 , 如 娜扣 , , 一 , , 璐 以 面 】 以沼 陷 , 男 , 一 对 罗切 , 加娜 , 娜 , · 宜‘ 佃 忱 明 佑他 璐 , , 一 沈卿 , 即 , , 勿 比 ”罗 阴 切 山盯 , , 一 困 邓 秀新 , 肖顺元 , 邓 占鳌等 宜 昌橙 与伏令夏橙 种间体细胞 杂种 生 物工 程学报 , 卯 , 义 邓秀新 , 肖顺 元 , 章文才等 原生 质 体融合再生 叶 肉亲本类型植株 中国柑 桔 , 】卯 , 斌 一 邓 璐 , 哪 , 罗 ‘ 司 ’ 叫笋 , ‘ 伙一 ’ 比 , 男 , 一 邓秀新 , 份 , 墨 西哥来橄 与伏令夏橙 种 间体细胞杂种的育性研究 遗传 , 卯 、 一 卿 , , , 璐 罗 罗 暇 , 卯 , 斌 二 协 , 加卿 , 以 动 必 让 罗 界 罗 他 璐 犯 , 卯 , 山呢 爬 祀】 介曰 , , 邓 秀新 , 章文 才 柑枯小抱 子原生质体的分离 中国柑桔 , 】更沁 , 义 一 邓 秀新 , 章文 才 柑桔染色体倍性操纵 与育种 果 树科学 , 卯 , 增 刊 一 , 们。 , 川 二 一 一仙 , , 一