492 植物学报 侧,而在右侧加一大滴融合液,移动载物台,从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液 中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。2.当一方原生质体数量很少时,只 将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个 原生质体并保存在吸管中,然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体,一同样放到融合液 中。3.当双方原生质体数量均很少而体积又较小时,可将一方的原生质体先转移到另 方原生质体近旁,然后将两者一同吸入微吸管,转入酏合液中。在吸取和释放过程中注意 使2个原生质体尽量靠近,以便于在融合液中寻找和操作。4.在载玻片上操作比较方便 效率高,观察及摄影效果亦较好,但溶液因易蒸友而改变浓度,需及时补充新的溶液,否则 难以进行多次的融台擤作。为此,可改用小培养皿,在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分 蒸发。这样操作虽不如前法方便,但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三)关键因素 PEGG浓度在一定温度条件下,PEG浓度对融合速率影响很大。5%以下浓度只 能使其粘连,不能完成融合:25%PEG可使融合快速进行,15%左右的PEG融合速度适 中,便于仔细观察融合过程及显微摄影 2.渗透压调节剂在维持原生质体活力的条件下,一般以在较低渗的介质中有利于 融合。本实验是将原生质体由含0.45moM蔗糖或含0.48moM甘露醇的保存液中 转入含0.1moM甘露醇的融合液中融合,然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0.45mo蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而,在为防止水分蒸发而在融合液中 补加低渗溶液时,渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版I,7)重新分开 (图版I,8)。 3.原生质体粘底现象原生质体在PEG中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体 融合中如果发生这种现象,对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识,作者分 下列3种处理作了比较试验,每组做50对原生质体第1组,在融合过程中控制每对原生 质体不使粘底。结果100%都可完成融合,第2组,先使一方原生质体粘底,再将另一方原 生质体移近与之粘连,结果仅24%完成融合,余则停滞于葫芦形状态等不同阶段第 组,将双方原生质体两两成对靠拢但在相互粘连前先使之粘底。结果100%均停滞在仅 仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时,原生质体粘底的拉力和原生质体相向 压缩的拉力相拮抗,常使原生质体变形拉长。 讨论 传统的PEG诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是 其中的“小规模融合”0,仍然是基于原生质体群体中的随机融合,不能摆脱融合结果的 盲目性。本文提出的PEG诱导的成对原生质体融合方法,是PEG技术的一次重要革新。 其优点在于:第1,无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素,可以简 化前期处理,第2,特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外 融合实验时,供试的卵细胞数量很有限,在这种情况下,群体融合是无法奏效的,唯有成对 融合可行,第3,可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体,排除未融合的原生质体、亲 本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况第4,因此也无需采用 o1994-2008ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:/www.cnki.net侧, 而在右侧加一大滴融合液, 移动载物台, 从左侧选取一对原生质体释入右侧的融合液 中使之融合。这样可以反复进行多对原生质体的融合。21 当一方原生质体数量很少时, 只 将数量多的一方原生质体悬浮液滴于载玻片左侧。操作时先用微吸管吸取数量少的一个 原生质体并保存在吸管中, 然后由载玻片左侧再吸入另一个原生质体, 一同释放到融合液 中。31 当双方原生质体数量均很少而体积又较小时, 可将一方的原生质体先转移到另一 方原生质体近旁, 然后将两者一同吸入微吸管, 转入融合液中。在吸取和释放过程中注意 使 2 个原生质体尽量靠近, 以便于在融合液中寻找和操作。41 在载玻片上操作比较方便, 效率高, 观察及摄影效果亦较好。但溶液因易蒸发而改变浓度, 需及时补充新的溶液, 否则 难以进行多次的融合操作。为此, 可改用小培养皿, 在融合液上覆盖一层石蜡油以防水分 蒸发。这样操作虽不如前法方便, 但可连续进行多次融合而不必更换溶液。 (三) 关键因素 11PEGG 浓度 在一定温度条件下, PEG 浓度对融合速率影响很大。5% 以下浓度只 能使其粘连, 不能完成融合: 25% PEG 可使融合快速进行; 15% 左右的 PEG 融合速度适 中, 便于仔细观察融合过程及显微摄影。 21 渗透压调节剂 在维持原生质体活力的条件下, 一般以在较低渗的介质中有利于 融合[ 9 ]。本实验是将原生质体由含 0145 molöL 蔗糖或含 0148 molöL 甘露醇的保存液中 转入含 011 molöL 甘露醇的融合液中融合, 然后在随后的中继液和清洗液中逐步恢复到 0145 molöL 蔗糖浓度。这样有利于融合体的稳定。然而, 在为防止水分蒸发而在融合液中 补加低渗溶液时, 渗透压的骤降反而会使已经粘连一体的原生质体(图版É , 7) 重新分开 (图版É , 8)。 31 原生质体粘底现象 原生质体在 PEG 中极易粘附于玻皿底部。在成对原生质体 融合中如果发生这种现象, 对融合及融合体的转移都很不利。为了证实这一认识, 作者分 下列 3 种处理作了比较试验, 每组做 50 对原生质体: 第 1 组, 在融合过程中控制每对原生 质体不使粘底。结果 100% 都可完成融合; 第 2 组, 先使一方原生质体粘底, 再将另一方原 生质体移近与之粘连, 结果仅 24% 完成融合, 余则停滞于葫芦形状态等不同阶段; 第 3 组, 将双方原生质体两两成对靠拢, 但在相互粘连前先使之粘底。结果 100% 均停滞在仅 仅相贴的状态而不能通过相向压缩完成融合。此时, 原生质体粘底的拉力和原生质体相向 压缩的拉力相拮抗, 常使原生质体变形拉长。 讨 论 传统的 PEG 诱导的原生质体融合技术是以有大量的供试原生质体为前提的。即使是 其中的“小规模融合”[ 10 ] , 仍然是基于原生质体群体中的随机融合, 不能摆脱融合结果的 盲目性。本文提出的 PEG 诱导的成对原生质体融合方法, 是 PEG 技术的一次重要革新。 其优点在于: 第 1, 无需考虑原生质体纯化程度、融合时双亲原生质体密度等因素, 可以简 化前期处理; 第 2, 特别适用于供试原生质体数量极少的场合。例如在进行雌雄配子体外 融合实验时, 供试的卵细胞数量很有限, 在这种情况下, 群体融合是无法奏效的, 唯有成对 融合可行; 第 3, 可以确保融合体均来自选定的双亲原生质体, 排除未融合的原生质体、亲 本原生质体自相融合、多个原生质体融合等等不希望出现的情况; 第 4, 因此也无需采用 294 植 物 学 报 36 卷