第五届(2016)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第四届全球肉鸡产业研讨会 术路线是将 NDV CDNA置于转录载体7启动子之后、肝炎病毒核酶基因和T7终止子之前构建出转 录载体,同时与表达NP、P、L蛋白的质粒共转染,转染到能表达T7RNA聚合酶的痘病毒感染的细 胞或直接能表达T7RNA聚合酶的细胞系,在细胞内组装后,获得具有感染性的病毒粒子。目前已有 lasota、 Clone30、 Beaudette C阗、 Hitchner B、Hers33和 Anhinga株6个鸡源NDⅤ毒株被成 功拯救 3新城疫病毒载体的应用 3.1新城疫病毒载体在基础研究中的应用 NDV反向遗传操作系统的出现促进了对NDV的病毒蛋白致病力与免疫系统相互作用的研究,首 先是在构建的 NDV CDNA克隆上对病毒基因组进行突变、缺失、替换或插入等操作,随后硏究重组病 毒的感染、复制机制及其他生物学特性。1999年, Peeters等报道了第一个被拯救的 NDV LaSota株 他们将 LaSota株的F基因决定毒力的3个非碱性氨基酸全部突变为碱性氨基酸,结果无毒株变为强毒 株,证实了F基因的裂解位点是影响毒力的重要因素向。2004年, Huang等将NDⅤ强毒株和无毒株的 HN基因进行调换,两株拯救株的毒力均发生了变化,说明F基因的裂解位点不是唯一影响毒力的因素 I。200年, Peeters等以编码分泌性碱性磷酸酶(SEAP)基因为报告基因构建了NDV微型基因组系 统,发现只有当基因组的大小为6的倍数时微型基因组RNA才能有效复制,充分的证明了新城疫病毒 的复制需要遵循“6碱基原则”l2002年, Mebatsion t等用鼠肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位取代 NDⅤ的NP蛋白的优势抗原表位,杂合体病毒可以达到亲本病毒的生长滴度,说明编码NP优势抗原 表位基因的缺失不影响病毒的转录复制及包装12。 3.2新城疫病毒载体在疫苗研究中的应用 Krishnamurthy等在2001年首次将含有 NDV GE和GS序列的氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)插入 NDⅤ中等毒力毒株 Beaudette o的HN-L位置,被拯救的重组病毒在鸡胚成纤维细胞上进行传代可以 稳定表达CAT8代以上,但是重组病毒的毒力和增殖滴度相较于NDV亲本毒株有所下降阿。 2004年, Huang等以 NDV LaSota株为载体,表达了传染性囊病病毒(IBDV)GLS-5变异株免疫 原ⅤP2基因,成功拯救获得重组病毒 lAsOta/VP。重组病毒的遗传稳定性良好,VP2基因可在鸡胚中 稳定表达12代。以10EID50的重组病毒剂量于2日龄和23日龄两次免疫鸡群,可达到100%保护免 疫鸡抵抗NDⅤ强毒 Texas-GB和IBDⅤGLS-5的致死性攻击。2005年, Alexander e等将人3型副 流感病毒(HPⅠV3)HN基因插到NDⅤ基因组的PM基因之间,拯救的病毒滴度较亲本病毒略有降低 但使用重组病毒免疫实验动物后可以产生针对HPV3HN蛋白较高的抗体水平14。2006年,Man等以 NDⅤBl株为载体,将H7亚型禽流感病毒的HA基因插入到PM基因之间,用这个重组病毒免疫鸡 之后可同时获得抵抗NDV强毒和H7亚型禽流感病毒的能力5。2007年, Dinapoli J M等将高致病性 禽流感病毒( HPAIV)HSNⅠ血凝糖蛋白插入到 NDV Beaudette C株的PM基因之间,该重组病毒免疫 鸡群后可预防 HPAIV H5N1所导致的死亡和降低发病率,此外还可诱导大量的黏膜免疫球蛋白A的反 应。同年 DinapoliJ M等还构建了严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒( SARSV)的重组NDV 载体,通过呼吸道用2个剂量免疫非洲绿猴均可产生较高的抗体效价,当试验动物免疫重组病毒后用 高剂量的 SARSV攻毒时,可降低试验动物死亡率η。2012年, Lisette Ah等将HSNl流感病毒的HA 基因插入到NDⅤ病毒的P-M基因之间,使HA蛋白得到表达,用该重组病毒对鸡进行免疫,3周后可 有效的降低死亡率,同时可减轻HPAV临床症状18。2014年, Kanabagatte Basavarajapp等以NDV LaSota株为载体,分别表达了禽传染性喉气管炎病毒的3种囊膜糖蛋白gB、gC、g,成功获得了3株 280中国畜牧业协会禽业分会第五届(2016)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第四届全球肉鸡产业研讨会 280 术路线是将 NDV cDNA 置于转录载体 T7 启动子之后、肝炎病毒核酶基因和 T7 终止子之前构建出转 录载体，同时与表达 NP、P、L 蛋白的质粒共转染，转染到能表达 T7 RNA 聚合酶的痘病毒感染的细 胞或直接能表达 T7 RNA 聚合酶的细胞系，在细胞内组装后，获得具有感染性的病毒粒子。目前已有 LaSota[4]、Clone 30[5]、Beaudette C[6]、Hitchner B1[7]、Herts 33[8]和 Anhinga 株[9]6 个鸡源 NDV 毒株被成 功拯救。 3 新城疫病毒载体的应用 3.1 新城疫病毒载体在基础研究中的应用 NDV 反向遗传操作系统的出现促进了对 NDV 的病毒蛋白致病力与免疫系统相互作用的研究，首 先是在构建的 NDV cDNA 克隆上对病毒基因组进行突变、缺失、替换或插入等操作，随后研究重组病 毒的感染、复制机制及其他生物学特性。1999 年，Peeters 等报道了第一个被拯救的 NDV LaSota 株， 他们将 LaSota 株的 F 基因决定毒力的 3 个非碱性氨基酸全部突变为碱性氨基酸，结果无毒株变为强毒 株，证实了 F 基因的裂解位点是影响毒力的重要因素[4]。2004 年，Huang 等将 NDV 强毒株和无毒株的 HN 基因进行调换，两株拯救株的毒力均发生了变化，说明 F 基因的裂解位点不是唯一影响毒力的因素 [10]。2000 年，Peeters 等以编码分泌性碱性磷酸酶（SEAP）基因为报告基因构建了 NDV 微型基因组系 统，发现只有当基因组的大小为 6 的倍数时微型基因组 RNA 才能有效复制，充分的证明了新城疫病毒 的复制需要遵循“6 碱基原则”[11]。2002 年，Mebatsion T 等用鼠肝炎病毒的 S2 糖蛋白抗原表位取代 NDV 的 NP 蛋白的优势抗原表位，杂合体病毒可以达到亲本病毒的生长滴度，说明编码 NP 优势抗原 表位基因的缺失不影响病毒的转录复制及包装[12]。 3.2 新城疫病毒载体在疫苗研究中的应用 Krishnamurthy 等在 2001 年首次将含有 NDV GE 和 GS 序列的氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）插入 NDV 中等毒力毒株 Beaudette C 的 HN-L 位置，被拯救的重组病毒在鸡胚成纤维细胞上进行传代可以 稳定表达 CAT 8 代以上，但是重组病毒的毒力和增殖滴度相较于 NDV 亲本毒株有所下降[6]。 2004 年，Huang 等以 NDV LaSota 株为载体，表达了传染性囊病病毒（IBDV）GLS-5 变异株免疫 原 VP2 基因，成功拯救获得重组病毒 rLaSota/VP。重组病毒的遗传稳定性良好，VP2 基因可在鸡胚中 稳定表达 12 代。以 104EID50 的重组病毒剂量于 2 日龄和 23 日龄两次免疫鸡群，可达到 100%保护免 疫鸡抵抗 NDV 强毒 Texas-GB 和 IBDV GLS-5 的致死性攻击[13]。2005 年，Alexander B 等将人 3 型副 流感病毒（HPIV3）HN 基因插到 NDV 基因组的 P-M 基因之间，拯救的病毒滴度较亲本病毒略有降低， 但使用重组病毒免疫实验动物后可以产生针对 HPIV3 HN 蛋白较高的抗体水平[14]。2006 年，Man 等以 NDV B1 株为载体，将 H7 亚型禽流感病毒的 HA 基因插入到 P-M 基因之间，用这个重组病毒免疫鸡 之后可同时获得抵抗 NDV 强毒和 H7 亚型禽流感病毒的能力[15]。2007 年，Dinapoli J M 等将高致病性 禽流感病毒（HPAIV）H5N1 血凝糖蛋白插入到 NDV Beaudette C 株的 P-M 基因之间，该重组病毒免疫 鸡群后可预防 HPAIV H5N1 所导致的死亡和降低发病率，此外还可诱导大量的黏膜免疫球蛋白 A 的反 应[16]。同年 Dinapoli J M 等还构建了严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒（SARSV）的重组 NDV 载体，通过呼吸道用 2 个剂量免疫非洲绿猴均可产生较高的抗体效价，当试验动物免疫重组病毒后用 高剂量的 SARSV 攻毒时，可降低试验动物死亡率[17]。2012 年，Lisette A.H.等将 H5N1 流感病毒的 HA 基因插入到 NDV 病毒的 P-M 基因之间，使 HA 蛋白得到表达，用该重组病毒对鸡进行免疫，3 周后可 有效的降低死亡率，同时可减轻 HPAIV 临床症状[18]。2014 年，Kanabagatte Basavarajapp 等以 NDV LaSota 株为载体，分别表达了禽传染性喉气管炎病毒的 3 种囊膜糖蛋白 gB、gC、gD，成功获得了 3 株