研究综述 新城疫病毒载体的研究进展 王晓波1,马兴树2,王振华1,石虎1,刘传青1,杨广平 (1河北科星药业有限公司河欣科技中心生物工程实验室,石家庄050200; 2河北工程大学农学院分子生物学实验室,河北邯郸056021 摘要:随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体已经成为病毒载体研究的热 ,本文综述了新城疫病毒载体疫苗的优点及其在外源基因表达方面的研究进展。 关键词:新城疫病毒;反向遗传操作技术;載体;应用 新城疫( Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒( Newcastle disease virus,NDV)引起的一种以 呼吸困难、精神紊乱、高热、下痢、黏膜及浆膜岀血为特征的禽类高度接触性传染病,给世界养禽业造 成了严重经济损失,是目前较为严重的家禽病毒性传染病之一。现就NDV分子生物学特性,重组 NDV使用的反向遗传操作技术,以及NDV载体的研究和应用进展进行论述。 新城疫病毒分子生物学特性 新城疫病毒是单股负链RNA病毒目( Mononegavirales)、副粘病毒科( Paramyxoviridae)、禽腮腺 炎病毒属( Rubulavirus),禽副黏病毒I型( Avian Paramyxovirus I, APMV-I)的成员2。NDⅤ基因组 长为15186nt、15192nt或15198nt,符合“6碱基原则”,NDV基因组3’端为55nt长的引导序列( leader sequence),5’端为14rt或56nt的尾随序列( trailer sequence),编码的6种结构蛋白分别是:核衣壳 蛋白( Nucleocapsid Protein, NP),磷蛋白( Phosphate Protein, P),基质蛋白(Matiⅸ,M,融合蛋白( Fusion Protein, F),血凝集素神经氨酸酶蛋白( Hemagglutinin Neuraminidase Protein, HN),大聚合酶蛋白( Large Protein,L),6个结构蛋白的排列顺序为:3- NP-P-M-F-HN-L-5。其中NP、P、L为内部蛋白,共同形 成核糖核蛋白复合物RNP,参与病毒RNA的转录与复制:M、F、HN属于外部蛋白,M蛋白是成熟 病毒粒子内部最富集的蛋白,它和核衣壳的亲和作用促进形成出芽的病毒粒子。F蛋白起初以非活性前 体F的形式存在,随后在细胞内特定蛋白酶作用下裂解生成F1和F2,使子代病毒得到感染性。HN 蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性,在病毒对机体的侵染过程中起到了识别细胞受体、介导病毒吸附 细胞膜、活化F蛋白以及释放成熟病毒粒子的作用 2新城疫病毒的反向遗传操作技术的建立 RNA反向遗传学技术,主要是指通过构建病毒全基因组cDNA分子克隆,在DNA水平上对RNA 病毒进行人工定向操作与修饰,然后通过体外转录RNA的方法获得具有感染性的子代病毒,从而研究 病毒目标基因结构和功能的关系。NDV是负链RNA病毒,它的复制需要病毒核蛋白和聚合酶,仅基 因组RNA或cDNA克隆转录没有感染性,无法启动病毒的复制周期。构建NDV感染性分子克隆的技 Q中国畜牧业协会禽业分会279
研究综述 279 新城疫病毒载体的研究进展 王晓波 1※，马兴树 2，王振华 1，石 虎 1，刘传青 1，杨广平 1※※ （1.河北科星药业有限公司河欣科技中心生物工程实验室，石家庄 050200； 2.河北工程大学农学院分子生物学实验室，河北邯郸 056021） 摘 要：随着反向遗传学操作技术的快速发展，重组新城疫病毒载体已经成为病毒载体研究的热 点，本文综述了新城疫病毒载体疫苗的优点及其在外源基因表达方面的研究进展。 关键词：新城疫病毒；反向遗传操作技术；载体；应用 新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种以 呼吸困难、精神紊乱、高热、下痢、黏膜及浆膜出血为特征的禽类高度接触性传染病，给世界养禽业造 成了严重经济损失，是目前较为严重的家禽病毒性传染病之一[1]。现就 NDV 分子生物学特性，重组 NDV 使用的反向遗传操作技术，以及 NDV 载体的研究和应用进展进行论述。 1 新城疫病毒分子生物学特性 新城疫病毒是单股负链 RNA 病毒目（Mononegavirales）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）、禽腮腺 炎病毒属（Rubulavirus），禽副黏病毒 I 型（Avian Paramyxovirus Ι, APMV-Ι）的成员[2]。NDV 基因组 长为 15186 nt、15192 nt 或 15198 nt，符合“6 碱基原则”，NDV 基因组 3’端为 55 nt 长的引导序列（leader sequence），5’端为 114 nt 或 56 nt 的尾随序列（trailer sequence），编码的 6 种结构蛋白分别是：核衣壳 蛋白（Nucleocapsid Protein,NP），磷蛋白(Phosphate Protein,P)，基质蛋白(Matrix,M)，融合蛋白(Fusion Protein,F)，血凝集素神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin Neuraminidase Protein,HN)，大聚合酶蛋白(Large Protein,L)，6 个结构蛋白的排列顺序为：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’[3]。其中 NP、P、L 为内部蛋白，共同形 成核糖核蛋白复合物 RNP，参与病毒 RNA 的转录与复制；M、F、HN 属于外部蛋白，M 蛋白是成熟 病毒粒子内部最富集的蛋白，它和核衣壳的亲和作用促进形成出芽的病毒粒子。F 蛋白起初以非活性前 体 F0 的形式存在，随后在细胞内特定蛋白酶作用下裂解生成 F1 和 F2，使子代病毒得到感染性。HN 蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒对机体的侵染过程中起到了识别细胞受体、介导病毒吸附 细胞膜、活化 F 蛋白以及释放成熟病毒粒子的作用。 2 新城疫病毒的反向遗传操作技术的建立 RNA 反向遗传学技术，主要是指通过构建病毒全基因组 cDNA 分子克隆，在 DNA 水平上对 RNA 病毒进行人工定向操作与修饰，然后通过体外转录 RNA 的方法获得具有感染性的子代病毒，从而研究 病毒目标基因结构和功能的关系。NDV 是负链 RNA 病毒，它的复制需要病毒核蛋白和聚合酶，仅基 因组 RNA 或 cDNA 克隆转录没有感染性，无法启动病毒的复制周期。构建 NDV 感染性分子克隆的技 ※ 作者简介：王晓波（1989-），女，硕士，Tel:0311-80677101，E-mail:wangxiaobo819@126.com ※※通讯作者：杨广平（1956-），男，高级畜牧师， E-mail:ygpdml@gmail.com
第五届(2016)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第四届全球肉鸡产业研讨会 术路线是将 NDV CDNA置于转录载体7启动子之后、肝炎病毒核酶基因和T7终止子之前构建出转 录载体,同时与表达NP、P、L蛋白的质粒共转染,转染到能表达T7RNA聚合酶的痘病毒感染的细 胞或直接能表达T7RNA聚合酶的细胞系,在细胞内组装后,获得具有感染性的病毒粒子。目前已有 lasota、 Clone30、 Beaudette C阗、 Hitchner B、Hers33和 Anhinga株6个鸡源NDⅤ毒株被成 功拯救 3新城疫病毒载体的应用 3.1新城疫病毒载体在基础研究中的应用 NDV反向遗传操作系统的出现促进了对NDV的病毒蛋白致病力与免疫系统相互作用的研究,首 先是在构建的 NDV CDNA克隆上对病毒基因组进行突变、缺失、替换或插入等操作,随后硏究重组病 毒的感染、复制机制及其他生物学特性。1999年, Peeters等报道了第一个被拯救的 NDV LaSota株 他们将 LaSota株的F基因决定毒力的3个非碱性氨基酸全部突变为碱性氨基酸,结果无毒株变为强毒 株,证实了F基因的裂解位点是影响毒力的重要因素向。2004年, Huang等将NDⅤ强毒株和无毒株的 HN基因进行调换,两株拯救株的毒力均发生了变化,说明F基因的裂解位点不是唯一影响毒力的因素 I。200年, Peeters等以编码分泌性碱性磷酸酶(SEAP)基因为报告基因构建了NDV微型基因组系 统,发现只有当基因组的大小为6的倍数时微型基因组RNA才能有效复制,充分的证明了新城疫病毒 的复制需要遵循“6碱基原则”l2002年, Mebatsion t等用鼠肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位取代 NDⅤ的NP蛋白的优势抗原表位,杂合体病毒可以达到亲本病毒的生长滴度,说明编码NP优势抗原 表位基因的缺失不影响病毒的转录复制及包装12。 3.2新城疫病毒载体在疫苗研究中的应用 Krishnamurthy等在2001年首次将含有 NDV GE和GS序列的氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)插入 NDⅤ中等毒力毒株 Beaudette o的HN-L位置,被拯救的重组病毒在鸡胚成纤维细胞上进行传代可以 稳定表达CAT8代以上,但是重组病毒的毒力和增殖滴度相较于NDV亲本毒株有所下降阿。 2004年, Huang等以 NDV LaSota株为载体,表达了传染性囊病病毒(IBDV)GLS-5变异株免疫 原ⅤP2基因,成功拯救获得重组病毒 lAsOta/VP。重组病毒的遗传稳定性良好,VP2基因可在鸡胚中 稳定表达12代。以10EID50的重组病毒剂量于2日龄和23日龄两次免疫鸡群,可达到100%保护免 疫鸡抵抗NDⅤ强毒 Texas-GB和IBDⅤGLS-5的致死性攻击。2005年, Alexander e等将人3型副 流感病毒(HPⅠV3)HN基因插到NDⅤ基因组的PM基因之间,拯救的病毒滴度较亲本病毒略有降低 但使用重组病毒免疫实验动物后可以产生针对HPV3HN蛋白较高的抗体水平14。2006年,Man等以 NDⅤBl株为载体,将H7亚型禽流感病毒的HA基因插入到PM基因之间,用这个重组病毒免疫鸡 之后可同时获得抵抗NDV强毒和H7亚型禽流感病毒的能力5。2007年, Dinapoli J M等将高致病性 禽流感病毒( HPAIV)HSNⅠ血凝糖蛋白插入到 NDV Beaudette C株的PM基因之间,该重组病毒免疫 鸡群后可预防 HPAIV H5N1所导致的死亡和降低发病率,此外还可诱导大量的黏膜免疫球蛋白A的反 应。同年 DinapoliJ M等还构建了严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒( SARSV)的重组NDV 载体,通过呼吸道用2个剂量免疫非洲绿猴均可产生较高的抗体效价,当试验动物免疫重组病毒后用 高剂量的 SARSV攻毒时,可降低试验动物死亡率η。2012年, Lisette Ah等将HSNl流感病毒的HA 基因插入到NDⅤ病毒的P-M基因之间,使HA蛋白得到表达,用该重组病毒对鸡进行免疫,3周后可 有效的降低死亡率,同时可减轻HPAV临床症状18。2014年, Kanabagatte Basavarajapp等以NDV LaSota株为载体,分别表达了禽传染性喉气管炎病毒的3种囊膜糖蛋白gB、gC、g,成功获得了3株 280中国畜牧业协会禽业分会
第五届(2016)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第四届全球肉鸡产业研讨会 280 术路线是将 NDV cDNA 置于转录载体 T7 启动子之后、肝炎病毒核酶基因和 T7 终止子之前构建出转 录载体，同时与表达 NP、P、L 蛋白的质粒共转染，转染到能表达 T7 RNA 聚合酶的痘病毒感染的细 胞或直接能表达 T7 RNA 聚合酶的细胞系，在细胞内组装后，获得具有感染性的病毒粒子。目前已有 LaSota[4]、Clone 30[5]、Beaudette C[6]、Hitchner B1[7]、Herts 33[8]和 Anhinga 株[9]6 个鸡源 NDV 毒株被成 功拯救。 3 新城疫病毒载体的应用 3.1 新城疫病毒载体在基础研究中的应用 NDV 反向遗传操作系统的出现促进了对 NDV 的病毒蛋白致病力与免疫系统相互作用的研究，首 先是在构建的 NDV cDNA 克隆上对病毒基因组进行突变、缺失、替换或插入等操作，随后研究重组病 毒的感染、复制机制及其他生物学特性。1999 年，Peeters 等报道了第一个被拯救的 NDV LaSota 株， 他们将 LaSota 株的 F 基因决定毒力的 3 个非碱性氨基酸全部突变为碱性氨基酸，结果无毒株变为强毒 株，证实了 F 基因的裂解位点是影响毒力的重要因素[4]。2004 年，Huang 等将 NDV 强毒株和无毒株的 HN 基因进行调换，两株拯救株的毒力均发生了变化，说明 F 基因的裂解位点不是唯一影响毒力的因素 [10]。2000 年，Peeters 等以编码分泌性碱性磷酸酶（SEAP）基因为报告基因构建了 NDV 微型基因组系 统，发现只有当基因组的大小为 6 的倍数时微型基因组 RNA 才能有效复制，充分的证明了新城疫病毒 的复制需要遵循“6 碱基原则”[11]。2002 年，Mebatsion T 等用鼠肝炎病毒的 S2 糖蛋白抗原表位取代 NDV 的 NP 蛋白的优势抗原表位，杂合体病毒可以达到亲本病毒的生长滴度，说明编码 NP 优势抗原 表位基因的缺失不影响病毒的转录复制及包装[12]。 3.2 新城疫病毒载体在疫苗研究中的应用 Krishnamurthy 等在 2001 年首次将含有 NDV GE 和 GS 序列的氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）插入 NDV 中等毒力毒株 Beaudette C 的 HN-L 位置，被拯救的重组病毒在鸡胚成纤维细胞上进行传代可以 稳定表达 CAT 8 代以上，但是重组病毒的毒力和增殖滴度相较于 NDV 亲本毒株有所下降[6]。 2004 年，Huang 等以 NDV LaSota 株为载体，表达了传染性囊病病毒（IBDV）GLS-5 变异株免疫 原 VP2 基因，成功拯救获得重组病毒 rLaSota/VP。重组病毒的遗传稳定性良好，VP2 基因可在鸡胚中 稳定表达 12 代。以 104EID50 的重组病毒剂量于 2 日龄和 23 日龄两次免疫鸡群，可达到 100%保护免 疫鸡抵抗 NDV 强毒 Texas-GB 和 IBDV GLS-5 的致死性攻击[13]。2005 年，Alexander B 等将人 3 型副 流感病毒（HPIV3）HN 基因插到 NDV 基因组的 P-M 基因之间，拯救的病毒滴度较亲本病毒略有降低， 但使用重组病毒免疫实验动物后可以产生针对 HPIV3 HN 蛋白较高的抗体水平[14]。2006 年，Man 等以 NDV B1 株为载体，将 H7 亚型禽流感病毒的 HA 基因插入到 P-M 基因之间，用这个重组病毒免疫鸡 之后可同时获得抵抗 NDV 强毒和 H7 亚型禽流感病毒的能力[15]。2007 年，Dinapoli J M 等将高致病性 禽流感病毒（HPAIV）H5N1 血凝糖蛋白插入到 NDV Beaudette C 株的 P-M 基因之间，该重组病毒免疫 鸡群后可预防 HPAIV H5N1 所导致的死亡和降低发病率，此外还可诱导大量的黏膜免疫球蛋白 A 的反 应[16]。同年 Dinapoli J M 等还构建了严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒（SARSV）的重组 NDV 载体，通过呼吸道用 2 个剂量免疫非洲绿猴均可产生较高的抗体效价，当试验动物免疫重组病毒后用 高剂量的 SARSV 攻毒时，可降低试验动物死亡率[17]。2012 年，Lisette A.H.等将 H5N1 流感病毒的 HA 基因插入到 NDV 病毒的 P-M 基因之间，使 HA 蛋白得到表达，用该重组病毒对鸡进行免疫，3 周后可 有效的降低死亡率，同时可减轻 HPAIV 临床症状[18]。2014 年，Kanabagatte Basavarajapp 等以 NDV LaSota 株为载体，分别表达了禽传染性喉气管炎病毒的 3 种囊膜糖蛋白 gB、gC、gD，成功获得了 3 株
研究综述 重组病毒,将这三株重组病毒分别以单独或混合的方式免疫2周龄鸡,结果表明所有免疫组都可以100% 保护鸡抵抗NDⅤ强毒致死性攻击,但只有单独免疫gD组和混合免疫组可以完全抵抗禽传染性喉气管 炎病毒USDA株的致死性攻击9。 目前我国学者也进行了大量NDV作为疫苗载体的研究,2008年,葛金英等将IBDV的VP2基因 插入到 NDV LaSota株的PM基因之间,重组病毒经滴鼻点眼途径免疫鸡后21天进行NDV和IBDV 攻毒试验,结果表明对NDV强毒致死性攻击100%保护,对IDV攻击免疫保护率为90%ρ。2009年, Chen等将表达H5N1的亚型禽流感HA蛋白插入到新城疫病毒载体中,动物试验表明,免疫鸡产生很 强的抗体水平,能够对同型和不同型的H5N1流感病毒攻击产生保护率巸。0ll年,胡海霞将C型偏 肺病毒的G蛋白插入到NDⅤ LaSota株F-HN基因之间,对其进行免疫保护评估结果表明SPF火鸡接 种重组疫苗免疫后对两种疾病的保护率升高2。2013年,冯秋霖等将鸡毒支原体TMI蛋白成功的插 入到 NDV LaSota的PM基因之间,重组病毒接种1周龄雏鸡之后可诱导显著的鸡毒支原体抗体反应, 攻毒保护试验证明其保护率可达90%23。 4新城疫病毒作为活病毒载体疫苗的优点 NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫,其安全有效性已经被有力证明,NDV在细胞浆中完 成复制,从RNA到RNA不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能性;NDV只有一个血清型,遗 传相对稳定毒株间发生重组的可能性很小;NDⅤ弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫 及细胞免疫的形成,产生全面有效的免疫保护;疫苗可通过多种方式使用,如饮水、喷雾、滴鼻点眼或 注射,使用方便快捷 综上所述,利用反向遗传操作技术,以NDV作为疫苗载体的研究已经得到飞快的发展,上述研究 结果也为我们展示了NDV作为病原疫苗载体的巨大潜力。NDV作为一种有效的病毒载体正在受到越 来越多的关注,具有非常广阔的应用前景 参考文献: 蔡宝祥家畜传染病学M中国农业出版社,2001 Alexander d j. Newcastle disease, other avian paramyxoviruses, and pneumovirus infections [M/SAIF YMFA, GLISSON JR, MCDOUGALD LR, NOLAN LK, SWAYNE DE Diseases of Poultry. Ames, lowa State University Press. 2008: 75-116 Miller P J, Decanini E L, Afonso C L. Newcastle disease: Evolution of genotypes and the related diagnostic challenges] Infection Genetics Evolution Journal of Molecular Epidemiology Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2010, Peeters B P, De LeeuwOS, Koch G, et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[]. Journal of Virol, 1999, 73(6): 5001-5009 Romer-Oberdorfer A, Mundt E, Mebatsion T, et al. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA J]. Journal of General Virology, 1999, 80( pt 116): 2987-299 Krishnamurthy S, Huang Z, Samal S K. Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA: expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. J]- Virology, 2001, 278(1): 168-82 Nakaya T, Cros J, Park M S, et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector [ J] Journal of Virology, 2001 75(23)11868-11873 de Leeuw OS, Koch G, Hartog L, et al. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion Q中国畜牧业协会禽业分会281
研究综述 281 重组病毒，将这三株重组病毒分别以单独或混合的方式免疫2周龄鸡，结果表明所有免疫组都可以100% 保护鸡抵抗 NDV 强毒致死性攻击，但只有单独免疫 gD 组和混合免疫组可以完全抵抗禽传染性喉气管 炎病毒 USDA 株的致死性攻击[19]。 目前我国学者也进行了大量 NDV 作为疫苗载体的研究，2008 年，葛金英等将 IBDV 的 VP2 基因 插入到 NDV LaSota 株的 P-M 基因之间，重组病毒经滴鼻点眼途径免疫鸡后 21 天进行 NDV 和 IBDV 攻毒试验，结果表明对 NDV 强毒致死性攻击 100%保护，对 IBDV 攻击免疫保护率为 90%[20]。2009 年， Chen 等将表达 H5N1 的亚型禽流感 HA 蛋白插入到新城疫病毒载体中，动物试验表明，免疫鸡产生很 强的抗体水平，能够对同型和不同型的 H5N1 流感病毒攻击产生保护率[21]。2011 年，胡海霞将 C 型偏 肺病毒的 G 蛋白插入到 NDV LaSota 株 F-HN 基因之间，对其进行免疫保护评估结果表明 SPF 火鸡接 种重组疫苗免疫后对两种疾病的保护率升高[22]。2013 年，冯秋霖等将鸡毒支原体 TM1 蛋白成功的插 入到 NDV LaSota 的 P-M 基因之间，重组病毒接种 1 周龄雏鸡之后可诱导显著的鸡毒支原体抗体反应， 攻毒保护试验证明其保护率可达 90%[23]。 4 新城疫病毒作为活病毒载体疫苗的优点 NDV 弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有效性已经被有力证明，NDV 在细胞浆中完 成复制，从 RNA 到 RNA 不存在 DNA 阶段及与细胞基因组整合的可能性；NDV 只有一个血清型，遗 传相对稳定毒株间发生重组的可能性很小；NDV 弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫 及细胞免疫的形成，产生全面有效的免疫保护；疫苗可通过多种方式使用，如饮水、喷雾、滴鼻点眼或 注射，使用方便快捷。 综上所述，利用反向遗传操作技术，以 NDV 作为疫苗载体的研究已经得到飞快的发展，上述研究 结果也为我们展示了 NDV 作为病原疫苗载体的巨大潜力。NDV 作为一种有效的病毒载体正在受到越 来越多的关注，具有非常广阔的应用前景。 参考文献： 蔡宝祥.家畜传染病学[M]. 中国农业出版社, 2001. Alexander D J. Newcastle disease, other avian paramyxoviruses, and pneumovirus infections. [M]//SAIF YM F A, GLISSON JR, MCDOUGALD LR, NOLAN LK, SWAYNE DE. Diseases of Poultry. Ames; Iowa State University Press. 2008: 75–116. Miller P J, Decanini E L, Afonso C L. Newcastle disease: Evolution of genotypes and the related diagnostic challenges[J]. Infection Genetics & Evolution Journal of Molecular Epidemiology & Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2010, 10(1):26-35. Peeters B P, De Leeuw O S, Koch G, et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Journal of Virol, 1999, 73(6): 5001-5009. Römer-Oberdörfer A, Mundt E, Mebatsion T, et al. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.[J]. Journal of General Virology, 1999, 80 ( pt 11)(6):2987-2995. Krishnamurthy S ,Huang Z , Samal S K. Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA: expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation.[J]. Virology, 2001, 278(1):168-82. Nakaya T, Cros J , Park M S, et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.[J]. Journal of Virology, 2001, 75(23):11868-11873. de Leeuw O S, Koch G, Hartog L, et al. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion
第五届(2016)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第四届全球肉鸡产业研讨会 protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein. J. Gen. Virol. 86, 1759 1769U]Journal of General Virology, 2005, 86(Pt6): 1759-1769 郝景波,吴云舟,刘艾林等.利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒[东北农业大学学报,2010,41(10)73-77 Zhuhui H, Aruna P, Subbiah E, et al. The hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus determines tropism and virulence []. Journal of Virology, 2004, 78(8): 4 176-84 eeters B P H, Gruijthuijsen Y K, Leeuw O SD, et al. Genome replication of Newcastle disease virus: involvement of t ule-of-six[J]. Archives of virology, 2000, 145(9): 1829-45 Teshome M, Koolen M J M, Vaan L TC D, et al. Newcastle disease virus(NDV) marker vaccine: an immunodominant epitope on the nucleoprotein gene of NDV can be deleted or replaced by a foreign epitope P]. Journal of virology, 2002, 76(20):10138-46 Zhuhui H, Subbiah E, Yunus AS, et al. A recombinant Newcastle disease virus(NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus(IBDV) protects against NDV and IBDV.]. Journal of Virology, 2004, 78(18): 10054-63 Alexander B, Zhuhui H, Lijuan Y, et al. Recombinant newcastle disease virus expressing a foreign viral antigen is attenuated and highl isogenic in primates. J]. Jourmal of Virology, 2005, 79(21): 13275-84 Man-Seong P, John S, Adolfo G S, et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(21) pags 8203-8208 DinapoliJM, Lijuan Y, Amorsolo S, et al. Immunization of primates with a Newcastle disease virus-vectored vaccine via th espiratory tract induces a high titer of serum neutralizing antibodies against highly pathogenic avian influenza virus [J]. Journal of virology,2007,81(21):11560-8. napoli J M, Alexander K, Lijuan Y, et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. J. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104(23): 9788 Cornelissen LA H M, LeeuwOSD, Tacken M G, et al. Protective Efficacy of Newcastle Disease Virus Expressing Soluble Trimeric Hemagglutinin against Highly Pathogenic H5N1 Influenza in Chickens and Mice[J]. Plos One, 2012, 7(8) e44447 44447 Basavarajappa M K, Kumar S, Khattar S K, et al. A recombinant Newcastle disease virus (ND V)expressing infectious laryngotracheitis virus (ILTV) surface glycoprotein d protects against highly virulent ILTV and NDV challenges in chickens[J] Vaccine,2014,32(28):35553563 葛金英,温志远,高宏雷等表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株ⅤP基因重组新城疫病毒LaSωta疫苗株的构建卩] 中国农业科学,2008,41(1):243-251 Chen H, Bu Z. Development and application of avian influenza vaccines in China. J]. Current Topics in Mic 四V& 3330333):153-62 胡海霞. C亚型禽偏肺病毒糖蛋白和融合蛋白的重组新城疫病毒二价苗的构建及免疫效力评价D吉林大学 2011 霖,刘茂军,祁芳,等.表达鸡毒支原体TMI蛋白基因重组新堿疫病毒的构建及其免疫原性研究[.中国预防兽 医学报,2013(10779-782 282Q中国畜牧业协会禽业分会
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