③Glu蛋白酶 Glu—X V蛋白酶) ④Arg蛋白酶 ⑤Lys蛋白酶 ⑥Pro蛋白酶 Pr 肽段的分离纯化 ①电泳法SDS-PAGE 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法(DEAE- Cellulose、DEAE- Sephadex) 根据肽段的电荷特性分离 ③反相HPLC法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-c1法 要求:SDS一PAGE单带、HPLC单峰、N端单 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman法 次水解一个N端a.a (1)耦联 PITC+H2N-A-B-C-D…pB8=9,40℃PTC→A-B-C-D… (2)裂解 PTC-A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A+H2NB-C-D (3)转化 PTH—A 用GC或HPLC测定PTHA PTC肽:苯氨基硫甲酰肽 ATZ:噻唑啉酮苯胺(一氨基酸) PTH:苯乙内酰硫脲(一氨基酸) 稱耦联:得PTC肽 次循环裂解:ATZ-a 转化:PTH-aa 反应产率99%循环次数120 (偶联、降98% 解两步)90% DNS- Edman法 用DNS法测N末端,用 Edman法提供(n-1)肽段 A-B-C-D一E肽③Glu 蛋白酶 Glu——X （V8 蛋白酶） ④Arg 蛋白酶 Arg——X ⑤Lys 蛋白酶 X——Lys ⑥Pro 蛋白酶 Pro——X 肽段的分离纯化 ①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex） 根据肽段的电荷特性分离 ③反相ＨＰＬＣ法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l 法 要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman 法 一次水解一个Ｎ端 a.a （1）耦联 PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D…… （2）裂解 PTC—A-B-C-D……TFA 无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D （3）转化 ATZ—A PTH—A 用 GC 或 HPLC 测定 PTH-A PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸） 耦联：得 PTC 肽 一次循环 裂解：ATZ- a.a 转化：PTH-a.a 反应产率 99％ 循环次数 120 (偶联、降 98% 60 解两步） 90% 40 DNS-Edman 法 用 DNS 法测 N 末端，用 Edman 法提供（n-1）肽段。 Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽