蛋白质的一级结构(共价结构) 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构 蛋白质结构层次 级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构) ↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 超二级结构 构象(高级结构) 结构域 三级结构(球状结构) 四级结构(多亚基聚集体) 一级结构的要点 蛋白质测序的一般步骤 祥见P116 (1)测定蛋白质分子中多肽链的数目 (2)拆分蛋白质分子中的多肽链。 (3)测定多肽链的氨基酸组成。 (4)断裂链内二硫键。 (5)分析多肽链的N末端和C末端。 (6)多肽链部分裂解成肽段 (7)测定各个肽段的氨基酸顺序 (8)确定肽段在多肽链中的顺序 (9)确定多肽链中二硫键的位置 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸
蛋白质的一级结构（共价结构） 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。 蛋白质结构层次 一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） ↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 ↓ 超二级结构 ↓ 构象（高级结构） 结构域 ↓ 三级结构(球状结构) ↓ 四级结构(多亚基聚集体) 一级结构的要点 ． 蛋白质测序的一般步骤 祥见 P116 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成。 （4） 断裂链内二硫键。 （5） 分析多肽链的 N 末端和 C 末端。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位置。 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从 N 端直接测至 C 端，但目前只能测 60 个 N 端氨基酸
直接法(测蛋白质的序列) 两种以上特异性裂解法 N A法裂解A1_A2A3_A4 B法裂解B1B 用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽 段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链 间接法(测核酸序列推断氨基酸序列) 核酸测序,一次可测600-800bp 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠) (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 (2)DNS-cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基n=m 110 方法:凝胶过滤法、沉降系数法 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式 (1)非共价键结合 8mol/L尿素,SDS SDS-PAGE测分子量 (2)二硫键结合 过甲酸氧化 - +HCOOOI SO3H β巯基乙醇还原 举例::血红蛋白(a2B2) (注意,人的血红蛋白a和B的N端相同。) 分子量:M 拆亚基:M1、M2 两条带 拆二硫键:M1、M2 两条带 分子量关系:M=2M1+2M2 测定氨基酸组成 主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 ①Trp测定 对二甲基氨基苯甲醛590nm
直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽 段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 核酸测序，一次可测 600-800bp 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠） ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 ⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测 N 端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基 n= 方法：凝胶过滤法、沉降系数法 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式： ⑴非共价键结合 8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量 ⑵二硫键结合 过甲酸氧化： —S—S—+HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原： 举例:： 血红蛋白 (α2β2) （注意，人的血红蛋白α和β的 N 端相同。） 分子量： M 拆亚基： M1 、M2 两条带 拆二硫键： M1 、M2 两条带 分子量关系： M = 2M1 + 2M2 测定氨基酸组成 主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种 a.a 出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 ①Trp 测定 对二甲基氨基苯甲醛 590nm。 110 mw
②Cys测定 5、5一二硫代双(-2—硝基苯甲酸)DTNB,412nmn 端基分析 ①N端分析 DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提 DNFB法: Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯) 抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等 PIT法: Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。 ②C端分析 A.肼解法 HLN-A-BC- D-COOH无水肼NHN2100℃5-10h H2、D-COOH 氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。 B.羧肽酶法(Pro不能测) 羧肽酶A:除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B:只水解Arg、Lys NH2N… .Val--Ser-Gly C 图P118羧肽酶法测C末端 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 化学裂解法 ①溴化氰 产率85% ②亚碘酰基苯甲酸 产率70-100% 8NTCB(2硝基-5-硫氰苯甲酸)-xCy↓ 羟胺NH2OH 约150个氨基酸出现一次 酶法裂解 ①胰蛋白酶 (X≠Pro) ②胰凝乳蛋白酶 (X≠Pro) Phe-—X 胃蛋白酶
②Cys 测定 5、5 /一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm 端基分析 ①N 端分析 DNS-cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的 DNS-氨基酸不需要提 取。 DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色 DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯） 抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等 PITC 法：Edman 法，逐步切下。无色 PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。 ②C 端分析 A．肼解法 H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NH2NH2 100℃ 5-10h。 A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH 氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C 端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg 不能用此法。 B．羧肽酶法（Pro 不能测） 羧肽酶 A：除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C 端 a.a 羧肽酶 B：只水解 Arg、Lys N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C 图 P118 羧肽酶法测 C 末端 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 化学裂解法 ①溴化氰 —Met—X— 产率 85% ②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率 70-100% ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys— ④羟胺 NH2OH —Asn—Gly— 约 150 个氨基酸出现一次 酶法裂解 ①胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X ②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro) Trp——X Phe——X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶 Glu—X V蛋白酶) ④Arg蛋白酶 ⑤Lys蛋白酶 ⑥Pro蛋白酶 Pr 肽段的分离纯化 ①电泳法SDS-PAGE 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法(DEAE- Cellulose、DEAE- Sephadex) 根据肽段的电荷特性分离 ③反相HPLC法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-c1法 要求:SDS一PAGE单带、HPLC单峰、N端单 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman法 次水解一个N端a.a (1)耦联 PITC+H2N-A-B-C-D…pB8=9,40℃PTC→A-B-C-D… (2)裂解 PTC-A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A+H2NB-C-D (3)转化 PTH—A 用GC或HPLC测定PTHA PTC肽:苯氨基硫甲酰肽 ATZ:噻唑啉酮苯胺(一氨基酸) PTH:苯乙内酰硫脲(一氨基酸) 稱耦联:得PTC肽 次循环裂解:ATZ-a 转化:PTH-aa 反应产率99%循环次数120 (偶联、降98% 解两步)90% DNS- Edman法 用DNS法测N末端,用 Edman法提供(n-1)肽段 A-B-C-D一E肽
③Glu 蛋白酶 Glu——X （V8 蛋白酶） ④Arg 蛋白酶 Arg——X ⑤Lys 蛋白酶 X——Lys ⑥Pro 蛋白酶 Pro——X 肽段的分离纯化 ①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex） 根据肽段的电荷特性分离 ③反相ＨＰＬＣ法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l 法 要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman 法 一次水解一个Ｎ端 a.a （1）耦联 PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D…… （2）裂解 PTC—A-B-C-D……TFA 无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D （3）转化 ATZ—A PTH—A 用 GC 或 HPLC 测定 PTH-A PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸） 耦联：得 PTC 肽 一次循环 裂解：ATZ- a.a 转化：PTH-a.a 反应产率 99％ 循环次数 120 (偶联、降 98% 60 解两步） 90% 40 DNS-Edman 法 用 DNS 法测 N 末端，用 Edman 法提供（n-1）肽段。 Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图 有色 Edman法 荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理: Edman法,可测60肽。 1967液相测序仪 自旋反应器,适于大肽段。 1971固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦连肽段的C端。 1981气相测序仪 用 Polybrene反应器 (聚阳离子)四级铵盐聚合物 液相:5nmol20-40肽97% 气相:5pmol 肽 肽段拼接成肽链 16肽,N端HC端 A法裂解: ONS PS EOVE RLA HOWT B法裂解: SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列: HOW TONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定(双向电泳法) 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化一S—S—生成-SOH 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽,测 与拼接出的肽链比较,定出二硫键的位置 酰胺的确定 酶解肽链,产生含单个Asx或Glx的肽,用电泳法确定是Asp还是Asn 举例:Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时,电荷量是Leu'Pro°al 此肽除Glx外,净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接,-N-糖苷-0-糖苷 脂类:Ser、Thr、Cys 磷酸:Ser、Thr、His 经验性序列:Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO)
图 有色 Edman 法 荧光基团或有色试剂标记的 PITC 试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman 法，可测 60 肽。 1967 液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。 1971 固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981 气相测序仪 用 Polybrene 反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40 肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98% 肽段拼接成肽链 16 肽，Ｎ端 H Ｃ端Ｓ Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定（双向电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 酰胺的确定 Asp –Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个 Asx 或 Glx 的肽，用电泳法确定是 Asp 还是 Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val 肽在 pH=6.0 时，电荷量是 Leu + Pro0 Val- 此肽除 Glx 外，净电荷为 0，可根据此肽的电泳行为确定是 Glu 或是 Gln。 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过 Asn、Ser 与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷 脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
" g-Thr-Leu-Ser(PO) Lys(arg)-Ala-Ser(PO 蛋白质的一级结构与生物功能 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能 蛋白质一级结构举例 (1)牛胰岛素 Sanger于1953年首次完成测序工作 P128图3-38 分子量:5700 dalton 51个a.a残基,A链21个残基,B链30个残基 A链内有一个二硫键Cys6-Cys11 A.B链间有二个二硫键 A Cys 7-B Cys 7 A Cys 20-B Cys 19 (2)核糖核酸酶 ase P128图3-39 分子量:12600 个a.a残基 4个链内二硫键。 牛胰 RNase变性一复性实验 P164图3-69。 (8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析,透析后构象恢复 活性恢复95%以上,而二硫键正确复性的概率是1/105。 (3)人血红蛋白a和β链及肌红蛋白的一级结构 P129图3-40 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 同源蛋白质:在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如:血红蛋白在不同的脊椎动 物中都具有输送氧气的功能,细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分 同源蛋白质的特点 ①多肽链长度相同或相近 ②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的,称不变 残基,不变残基高度保守,是必需的。 ③除不变残基以外,其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化,称可变残基,可变残 基中,个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化,亲源 关系越远,同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。 细胞色素C 存在于线粒体膜内,在真核细胞的生物氧化过程中传递电子
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4) Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4) 蛋白质的一级结构与生物功能 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能 蛋白质一级结构举例： （1） 牛胰岛素 Sanger 于 1953 年首次完成测序工作。 P128 图 3-38 分子量：5700 dalton 51 个 a.a 残基，A 链 21 个残基，B 链 30 个残基， A 链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11 A.B 链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7 A.Cys 20—B Cys 19 （2）核糖核酸酶（RNase） P128 图 3-39 分子量：12600 124 个 a.a 残基 4 个链内二硫键。 牛胰 RNase 变性一复性实验： P164 图 3-69。 (8M 尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复， 活性恢复 95%以上，而二硫键正确复性的概率是 1/105。 （3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构 P129 图 3-40 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动 物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。 同源蛋白质的特点： ①多肽链长度相同或相近 ②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变 残基，不变残基高度保守，是必需的。 ③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残 基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源 关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。 细胞色素 C 存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子
P130,图3-41 分子量:12500左右 氨基酸残基:100个左右,单链 25种生物中,细胞色素C的不变残基35个 60种生物中,细胞色素C的不变残基27个。 亲源关系越近的,其细胞色素C的差异越小。 亲源关系越远的,其细胞色素C的差异越大 人与黑猩猩 人与猴 1 人与狗 10 人与酵母 胰岛素 祥见P175胰岛素的结构与功能 不同生物的胰岛素a.a序列中,有24个氨基酸残基位置始终不变, A.B链上6个Cys不变(重要性),其余18(24-6)个氨基酸多数为非极性侧链,对 稳定蛋白质的空间结构起重要作用。 其它氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大,但对免疫反应起作用,猪与人接近, 而狗则与人不同,因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。 蛋白质一级结构的个体差异一分子病 分子病:基因突变引起某个功能蛋白的某个(些)氨基酸残基发生了遗传性替代从而导 致整个分子的三维结构发生改变,致使其功能部分或全部丧失 Linus pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的 成人的血红蛋白是由两条相同的a链和两条相同的β链组成aB2,镰刀形红细胞中,血红蛋白 β链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Ⅴal。因此,当血红蛋白没有携带O2时就 由正常的球形变成了刚性的棍棒形,病人的红细胞变成镰刀形,容易发生溶血作用(血细胞 溶解)导致病血,棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低 以血红蛋白为例:a2B2寡聚蛋白 正常人血红蛋白,B.N. Glu 镰刀型贫血 Val 6 生理条件下电荷: Val G 疏水亲水 人的血红蛋白分子的四条肽链中(574个氨基酸残基)只有两个G1u分子变化成Va1分 子,就能发生镰刀状细胞贫血病。 一级结构的部分切除与蛋白质的激活 一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在,只有切除部分多肽 后才呈现生物活性,如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原,消化系统的蛋白酶原、激 素前体等 血液凝固的机理 凝血因子(凝血酶原致活因子)
P130，图 3-41 分子量：12500 左右 氨基酸残基：100 个左右，单链。 25 种生物中，细胞色素 C 的不变残基 35 个。 60 种生物中，细胞色素 C 的不变残基 27 个。 亲源关系越近的，其细胞色素 C 的差异越小。 亲源关系越远的，其细胞色素 C 的差异越大。 人与黑猩猩 0 人与猴 1 人与狗 10 人与酵母 44 胰岛素 祥见 P175 胰岛素的结构与功能 不同生物的胰岛素 a.a 序列中，有 24 个氨基酸残基位置始终不变， A．B 链上 6 个 Cys 不变（重要性），其余 18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对 稳定蛋白质的空间结构起重要作用。 其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近， 而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。 蛋白质一级结构的个体差异—分子病 分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导 致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。 Linus Pauling 首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的， 成人的血红蛋白是由两条相同的链和两条相同的链组成22，镰刀形红细胞中，血红蛋白 链第 6 位的 aa 线基由正常的 Glu 变成了疏水性的 Val。因此，当血红蛋白没有携带 O2 时就 由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞 溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对 O2 的结合力比正常的低。 以血红蛋白为例：α2β2 寡聚蛋白 正常人血红蛋白，β.N......Glu 6 镰刀型贫血 β.N......Val 6 生理条件下电荷： Va10 Glu- 疏水 亲水 人的血红蛋白分子的四条肽链中（574 个氨基酸残基）只有两个 Glu 分子变化成 Va1 分 子，就能发生镰刀状细胞贫血病。 一级结构的部分切除与蛋白质的激活 一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽 后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激 素前体等。 血液凝固的机理 凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原 凝血酶 纤维蛋白原A 纤维蛋白B (1)、凝血藤原 P133图3-43凝血酶原的结构 糖蛋白,分子量66000,582个a.a残基,单链。 在凝血酶原致活因子催化下,凝血酶原分子中的Arg274-Thr275和Arg323-1le324 断裂,释放出274个a.a,产生活性凝血酶。 A链49aa 链259a.a (2)、纤维蛋白原 P133图3-44纤维蛋白原的结构 Bars α肽:600个氨基酸,β肽:461氨基酸,r肽:410个氨基酸 在凝血酶作用下,从二条a链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键- Arg-Gly-,释 放出二个纤维肽A(19个氨基酸)和二个纤维肽B(21个氨基酸),它们含有较多的酸性氨 基酸残基 P133纤维肽A.B的结构 A、B肽切除后,减少了蛋白质分子的负电荷,促进分子间聚集,形成网状结构。 P134上 在凝血因子XIa(纤维蛋白稳定因子)催化下,纤维蛋白质单体间形成共价健(Gln-Ls 结合),生成交联的纤维蛋白。 胰岛素原的激活 P134图3-45 胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成,称前胰岛素原,含信号肽。前胰岛素原 在信号肽的引导下,进入内质网腔,进入后,信号肽被信号肽酶切除,生成胰岛素原,被运 至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下,切除C肽,得到活性胰岛素 多肽与蛋白质的人工合成 在医药和研究方面意义重大 1958年,北大生物系合成催产素8肽。 1965年,中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素 1969年,美国 Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶一—牛胰 RNase
凝血酶原 凝血酶 纤维蛋白原 A 纤维蛋白 B 凝胶 （1）、 凝血酶原 P133 图 3-43 凝血酶原的结构 糖蛋白，分子量 66000，582 个 a.a 残基，单链。 在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的 Arg274—Thr275 和 Arg323—Ile324 断裂，释放出 274 个 a.a，产生活性凝血酶。 A 链 49 a.a B 链 259 a.a （2）、 纤维蛋白原 P133 图 3-44 纤维蛋白原的结构 α2β2r2 α肽：600 个氨基酸，β肽：461 氨基酸，r 肽：410 个氨基酸 在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的 N 端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释 放出二个纤维肽 A（19 个氨基酸）和二个纤维肽 B（21 个氨基酸），它们含有较多的酸性氨 基酸残基。 P133 纤维肽 A .B 的结构 A、B 肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。 P134 上 在凝血因子 XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys 结合），生成交联的纤维蛋白。 胰岛素原的激活 P134 图 3-45 胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原 在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运 至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除 C 肽，得到活性胰岛素。 多肽与蛋白质的人工合成 在医药和研究方面意义重大 1958 年，北大生物系合成催产素 8 肽。 1965 年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。 1969 年，美国 Merrifield 用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰 RNase
(124aa-)。 P139图3-46多肽的固相合成 端 N端 挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质 二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。 肽链的构象 多肽链的共价主链上所有的a一碳原子都参与形成单键,因此,从理论上讲,一个多 肽主链能有无限多种构象 但是,目前已知,一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象,且相当稳 定,这种构象称天然构象,此时蛋白质具有生物活性,这一事实说明:天然蛋白质主链上的 单键并不能自由旋转。 欣链的二面角 P143图3-51、图3-52 多肽主链上只有a碳原子连接的两个键(Ca一N和Ca-C2)是单键,能自由旋转。 环绕Ca一N键旋转的角度为Φ 环绕Ca-C2键旋转的角度称ψ 多肽链的所有可能构象都能用Φ和ψ这两个构象角来描述,称二面角。 当Φ的旋转键Ca-N两侧的N-C1和Ca-C2呈顺式时,规定Φ=0°。 当ψ的旋转键Ca-C2两侧的Ca-N和C2-N2呈顺式时,规定W=0°。 从Ca向N看,顺时针旋转Ca-N键形成的Φ角为正值,反之为负值。 从Ca向C2看,顺时针旋转Ca-C2键形成的平角为正值,反之为负值 多肽链折叠的空间限制 Φ和同时为0的构象实际不存在,因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0 原子的接触距离比其范德华半经之和小,空间位阻。 因此二面角(Φ、屮)所决定的构象能否存在,主要取决于两个相邻肽单位中非键合原 子间的接近有无阻碍。 Ca上的R基的大小与带电性影响Φ和甲 P144表3-12蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。 拉氏构象图: Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离,确定了哪些 成对二面角(Φ、)所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的,哪些是不允许的,并且以 Φ为横坐标,以ψ为纵坐标,在坐标图上标出,该坐标图称拉氏构象图。 P145拉氏构象图(Gly除外)
（124aa—）。 P139 图 3-46 多肽的固相合成 C 端 N 端。 挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质 二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。 肽链的构象 多肽链的共价主链上所有的 α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多 肽主链能有无限多种构象。 但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳 定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的 单键并不能自由旋转。 肽链的二面角 P143 图 3-51、图 3-52 多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1 和 Cα-C2）是单键，能自由旋转。 环绕 Cα—N 键旋转的角度为 Φ 环绕 Cα—C2 键旋转的角度称 Ψ 多肽链的所有可能构象都能用 Φ 和 Ψ 这两个构象角来描述，称二面角。 当 Φ 的旋转键 Cα-N1 两侧的 N1-C1 和 Cα-C2 呈顺式时，规定 Φ=0°。 当 Ψ 的旋转键 Cα-C2 两侧的 Cα-N1 和 C2-N2 呈顺式时，规定 Ψ=0°。 从 Cα向 N1 看，顺时针旋转 Cα-N1 键形成的 Φ 角为正值，反之为负值。 从 Cα向 C2 看，顺时针旋转 Cα- C2 键形成的 Ψ 角为正值，反之为负值。 多肽链折叠的空间限制 Φ 和 Ψ 同时为 0 的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基 H 原子和羰基 0 原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。 因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原 子间的接近有无阻碍。 Cα上的 R 基的大小与带电性影响 Φ 和 Ψ P144 表 3-12 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。 拉氏构象图：Ramachandran 根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些 成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以 Φ 为横坐标，以 Ψ 为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。 P145 拉氏构象图（Gly 除外）
(1)实线封闭区域 一般允许区,非键合原子间的距离大于一般允许距离,此区域内任何二面角确定的构象 都是允许的,且构象稳定 (2)虚线封闭区域 是最大允许区,非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间,立体化学 允许,但构象不够稳定 (3)虚线外区域 是不允许区,该区域内任何二面角确定的肽链构象,都是不允许的,此构象中非键合原 子间距离小于最小允许距离,斥力大,构象极不稳定。 Gly的Φ、ψ角允许范围很大。 总之,由于原子基因之间不利的空间相互作用,肽链构象的范围是很有限的,对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%,最大允许区占全平面20.3% 二级结构的基本类型 驱使蛋白质折叠的主要动力: (1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。 (2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状 态。 (3)、a螺旋及其特征 在α螺旋中,多肽主链按右手或左手方向盘绕,形成右手螺旋或左手螺旋,相邻的螺圈 之间形成链内氢键,构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、W 典型的a螺旋有如下特征: ①二面角:Φ=-57°,=-48°,是一种右手螺旋 回忆P143图3-52 ②每圈螺旋:3.6个a.a残基,高度:0.54nm ③每个残基绕轴旋转100°,沿轴上升0.15n ④氨基酸残基侧链向外 ⑤相邻螺圈之间形成链内氢链,氢键的取向几乎与中心轴平行。 ⑥肽键上NH氢与它后面(N端)第四个残基上的C=0氧间形成氢键。 图 这种典型的α螺旋用3.613表示,3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基,13表示氢键封闭 的环包括13个原子 2.21螺旋(n=1) 3。螺旋(n=2,Φ 63螺旋(n=3) 4.3螺旋(n=4) 封闭环原子数3n+4(n=1、2、 2.273 3.613 n=4
⑴实线封闭区域 一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象 都是允许的，且构象稳定。 ⑵虚线封闭区域 是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学 允许，但构象不够稳定。 ⑶虚线外区域 是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原 子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。 Gly 的 Φ、Ψ 角允许范围很大。 总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非 Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的 7.7%，最大允许区占全平面 20.3％。 二级结构的基本类型 驱使蛋白质折叠的主要动力： (1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。 (2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状 态。 α螺旋 （3）、 α螺旋及其特征 在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈 之间形成链内氢键，构成螺旋的每个 Cα都取相同的二面角 Φ、Ψ。 典型的α螺旋有如下特征： ① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋 回忆 P143 图 3-52 ② 每圈螺旋：3.6 个 a.a 残基， 高度：0.54nm ③ 每个残基绕轴旋转 100°，沿轴上升 0.15nm ④ 氨基酸残基侧链向外 ⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。 ⑥ 肽键上 N-H 氢与它后面（N 端）第四个残基上的 C=0 氧间形成氢键。 图 这种典型的α螺旋用 3.613 表示，3.6 表示每圈螺旋包括 3.6 个残基，13 表示氢键封闭 的环包括 13 个原子。 2.27 螺旋（n=1） 310 螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°） 613 螺旋（n=3） 4.316 螺旋（n=4） 封闭环原子数 3n+4（n=1、2、.....） 2.27 310 3.613 4.316 n=1 n=2 n=3 n=4
