第十三章DNA的复修复 生物体的遗传信息储存在DNA中,并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息 自DNA转录给RNA,然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能,使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958年, CRick提出中心法则: (1)以原DNA分子为模板,合成出相同DNA分子的过程。 (2)以某一段DNA分子为模板,合成出与其序列对应的RNA分子的过程 (3)以mRNA为模板,根据一联密码规则,合成对应蛋白质的过程。 中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。 图 DNA生物合成有两种方式:DNA复制和反转录 DNA体内复制涉及:原核、真核生物的染色体、细菌质粒(环状,双链)、真核细胞器DNA(线粒体 叶绿体)、病毒(双链,环状) DNA的体外复制:分子克隆。 DNA的复制 DNA半保留复制 1953年, Watson和〔ik在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复 P321图191wdon和〔ick提出的DNA双螺旋复制模型 在复制过程中,首先亲代双链解开,然后每条链作为模板,在其上合成互补的子代链,结果新形成的两 个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样,而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA 另一条是新合成的。 1958年, Meselson和Sah用N标记 E coli dNA,证明了DNA的复制是半保留复制。 P322图192DNA的半保留复制 1963年, Cairns用放射自显影法,在显微镜下首次观察到完整的正在复制的 E coli染色体DNA。 P323图19-3 H-脱氧胸苷标记 Ecoli dNA,经过将近两代时间,用溶菌酶消化细胞壁,将 Ecoli.DNA转至膜上, 干燥,压感光胶片,狃放出β粒子,还原银,在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA 是一个环状分子,并以半保留的形式进行复制。 DNA的半保留复制冋以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制,DNA的多核苷酸链仍可以保持 完整,并存在于后代而不被分解掉
１ 第十三章 DNA的复制和修复 生物体的遗传信息储存在 DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息 自 DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958 年，F.Crick 提出中心法则： （1）以原DNA 分子为模板，合成出相同DNA 分子的过程。 （2）以某一段DNA 分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。 （3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。 中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。 图 DNA 生物合成有两种方式：DNA 复制和反转录 DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、 叶绿体）、病毒（双链，环状） DNA 的体外复制：分子克隆。 第一节 DNA的复制 一、 DNA 半保留复制 1953 年，Watson 和 Crick 在提出 DNA双螺旋结构模型时就推测 DNA可能按照半保留机制进行自我复 制。 P321 图 191 Watson 和Crick 提出的DNA双螺旋复制模型 在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两 个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA， 另一条是新合成的。 1958 年，Meselson 和 Stahl用15N 标记E.coli.DNA，证明了DNA的复制是半保留复制。 P322 图 19-2 DNA 的半保留复制。 1963 年，Cairns 用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。 P323 图 19-3 3H-脱氧胸苷标记 E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将 E.coli. DNA 转至膜上， 干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA 是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。 DNA 的半保留复制可以说明 DNA 在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA 的多核苷酸链仍可以保持 完整，并存在于后代而不被分解掉
复制起点、单位和方向 DNA的复制是在起始阶段进行控制的,一旦复袆起始,它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、复制起点 复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时,两条链的复制起点并不总是在同一点上 (如D环复制)。 在一个完整的细胞周期中,每一个复制起点只使用一次,完成一次复制过程。 多数生物的复制起点,都是DNA呼吸作用强烈(甲醛变性实验)的区段,即经常开放的区段,富含AT ★环状DNA复制起点的确定方法 P325图196 ★复制起点的克隆和功能分析—一重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点oiC区IKb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样,受到严密控制,每 个细胞只有12个拷贝,用核酸外切酶缩短onC克隆片段的大小,最后得到245bp的基本功能区,携带它的 质粒依然能够自我复制,拷贝数可以增加到20以上,这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区,而决定 拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于段296bp的DNA片段上,与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性,而且 有些亲缘关系较远的细菌,其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此,复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 2、复制单位 复制子( Replicon): Genome能独立进行复制的单位,每个复制子都含有一个复制点 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子,它们都是单复制子,都在一个 固定的起点开始复制,复制方向大多数是双向的,少数是单向复制。多数是对称复制,少数是不对称复制( 条链复制后才进行另一条链的复制) 环状DNA的复制眼象θ,称θ形复制。 真核生物的染色体DNA是线形双链分子,含有许多复制起点,因此是多复制子,每个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子 病毒DNA多种多样,环状或线形,双链或单链,但都是单复制子。 3、复制方向 定点起始,复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制叉,少数是单向复制,形成 个复制叉。 ★用射自景验判断DNA的复制方向及速度 低方姓性科-膀胸苷 高姓性和H臃胸苷
２ 二、 复制起点、单位和方向 DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、 复制起点 复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上 （如 D 环复制）。 在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。 多数生物的复制起点，都是 DNA 呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含 A.T。 ★环状 DNA复制起点的确定方法 P325 图 19-6 ★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点 oriC 区 1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每 个细胞只有 1-2 个拷贝，用核酸外切酶缩短 oriC 克隆片段的大小，最后得到 245bp 的基本功能区，携带它的 质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到 20 以上，这说明发动复制的序列在 245bp 的基本功能区，而决定 拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb 之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段 296bp 的 DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有 86%同源性，而且 有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 2、 复制单位 复制子(Replicon)：Genome 能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器 DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个 固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一 条链复制后才进行另一条链的复制）。 环状 DNA 的复制眼象θ，称θ形复制。 真核生物的染色体 DNA 是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000 个复制子。 病毒 DNA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 3、 复制方向 定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成 一个复制叉。 ★用放射自显影实验判断DNA 的复制方向及速度 低放射性 3H-脱氧胸苷 高放射性 3H-脱氧胸苷
a.单向 b.双向等速 三种结果图形 C.双向异速 Eco的个温度敏株,在42C时,能吏DNA在成复袆后,不始新的复制过程,而在25°℃时 复制攻又能能恢复。 4、DNA的几种复制方式 (1)、直线双向复制 单点,双向,T7 多点,双向,真核染色体DNA (2)、θ型复制:环状双链DNA,单向或双向CE.coli.) (3)、滚环复制:环状犬单链DN,Φx174 (4)、D环复制:线粒体、叶绿体DN 5)、多复制叉复制 第一轮复制尚未完成,复制起点就开始第二轮的复制。 在Eco富营时,司采眵多复袆叉复制式 Ecoli. dna的复袆最快可50Kb/min,完全复袆需 omin,富营时,20min分裂。而真染色僳要68小时。 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子 目前已发现30多利酶及蛋白质因子参与DNA复制 DNA的聚合反应和聚合 DNA生物合成5→3,化学合成3→5 l、DNA聚合反应必备的条件 (1)DNA聚合酶 (2)DNA模板(反转录时用RNA模板) (3)引物(DNA、RNA或蛋白质) (4)4种dNIP
３ a. 单向 b. 双向等速 三种结果图形 c. 双向异速 E.coli.的一个温度敏感株，在 42℃时，能使 DNA 在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在 25℃时 复制功又能能恢复。 4、 DNA 的几种复制方式 （1）、 直线双向复制 单点，双向，T7 多点，双向，真核染色体DNA （2）、 θ型复制：环状双链 DNA，单向或双向（E .coli.） （3）、 滚环复制：环状单链 DNA，Φx174 （4）、 D 环复制：线粒体、叶绿体 DNA （5）、 多复制叉复制： 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。 在 E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA 的复制最快可达 50Kb/min，完全复制需 40min，富营养时，20min 分裂。而真核染色体要6-8小时。 三、 与 DNA复制有关的酶及蛋白质因子 目前已发现30 多种酶及蛋白质因子参与DNA复制 （一） DNA的聚合反应和聚合酶 DNA 生物合成 5 ，→3 ，，化学合成3 ，→5 ， 1、 DNA 聚合反应必备的条件 ⑴ DNA 聚合酶 ⑵ DNA 模板(反转录时用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质) ⑷ 4 种 dNTP
(5)Mg2+ 2、聚合反应过程及特点 总反应式: nIdATP DNA poL n2dGTP +DNA dGMP DNA+(n1+n2+n3+n4) Ppi n3dCTP nadTTP d TMP P329图19-10 P330图191 在链的延长过程中,链的游离3-羟基,对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击,生成3.5 磷酸二酯键,并脱下焦磷酸。 DNA聚合酶的反应特点 (1)以4种dNIP为底物 (2)反应需要接受模板的指导,不能催化游离的dNIP的聚合 (3)反应需有引物3羟基存在 (4)链生长方向5→3 (5)产物DNA的性质与模板相同 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331图1912 (1)发荚环结构ε加入单链DNA作为模板和引物,3羟基端回折成引物链。 (2)末端延伸聚合:加入双链DNA作为模板和引物,3’末端突出作为模板。 (3)分枝型和切口平移型聚合:加入双链DNA,聚合发生在切口或末端单链区。 (4)环形聚合:加入带引物的环形DNA作为模板。 4、E. coli dNA聚合酶 (1) E coli. DNA pol I (Kornberg A, 400 copy/cell) 单体酶,分子量10Kd,含一个Zm2,每个细胞中含400个 DNA pol.I 催化活性: 5→3′聚合活性 3→5外切活性 5→3外切活性 用蛋白水解酶将 DNApol.I部分水解可得: 大片段( Klenow),75Kd,活性:5→3聚合活性、3→5′外切活性。 小片段,36Kd,活性:5→3^外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分,切除修复) Klenow片段的用途: a补齐DNA3隐缩未端
４ ⑸ Mg 2+ 2、 聚合反应过程及特点 总反应式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP P329 图 19-10 P330 图19-11 在链的延长过程中，链的游离 3 ， -羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成 3 ， .5， -磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。 DNA 聚合酶的反应特点： ⑴ 以 4 种 dNTP 为底物 ⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP 的聚合。 ⑶ 反应需有引物3 ， -羟基存在 ⑷ 链生长方向5 ， → 3 ， ⑸ 产物 DNA的性质与模板相同 3、 由 DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331 图19-12 （1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3 ＇羟基端回折成引物链。 （2） 末端延伸聚合：加入双链DNA 作为模板和引物，3’末端突出作为模板。 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。 （4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA 作为模板。 4、 E.coli DNA聚合酶 （1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg 酶，400 copy/cell） 单体酶，分子量109Kd，含一个Zn 2+，每个细胞中含400 个DNA pol.Ⅰ 催化活性： 5 ， → 3 ， 聚合活性 3 ， → 5 ， 外切活性 5 ， → 3 ， 外切活性 用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得： 大片段（Klenow），75Kd，活性：5 ， → 3 ，聚合活性、3 ， → 5 ，外切活性。 小片段，36Kd，活性：5 ， → 3 ，外切活性（只作用于双链DNA 的碱基配对部分，切除修复）。 Klenow 片段的用途： a 补齐 DNA 3，隐缩未端
b.标记DNA片段未端 c.cDNA合成第二链 d.dDNA测序 (2)、E.coli. DNA Pol.Ⅱ(100copy/cell) 单体酶,分子量120Kd 催化活性:5→3聚合(活性很低 外切 可能在DNA的修复中起某中作用。 (3)、E. coli DNA polⅢ(复制酶,1020copy/eell) 寡聚酶,全酶由10种共22个亚基组成,a、ε和0三种亚基组成核心酶 P334表10-3 DNA pol.是合成新链DNA主要的酶,又称复制續 Replicase) PolⅢ的5→3外切酶活性只作用于单链DNA P334表192Ecoi三种DNA聚合酶的性质比较 ★DNA聚合酶有6个结合位点 (1)模板DNA结合位点 (2)引物结合位点 3)引物3OH位点、反应位点 (4)底物dNTP结合位点 (5)5→3外切位点(po没有) (6)3→5外切位点校正 5、真核生物DNA聚合酶 P334表194真核生物DNA聚合酶 真核DNA聚合酶般不具备外切活力,可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。 (1)DNA聚合酶α,多亚基,功能与 E coli. pol类似,是真核DNA复制酶。 (2)DNA聚合酶β,主要在DNA损伤的修复中起作用 (3)DNA聚合酶γ,从线粒体得到,可能与线粒体DNA的复制有关 (4)DNA聚合酶δ,特点:有3→5外切活力。 引物酶或RNA聚合酶(引发酶) 细胞内,DNA的复制需要引物(DNA或RNA),引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引
５ b. 标记 DNA片段未端 c．cDNA合成第二链 d．d DNA测序 （2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell） 单体酶，分子量120Kd 催化活性：5 ，→ 3 ，聚合(活性很低) 3 ，→ 5 ，外切 可能在 DNA的修复中起某中作用。 （3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell） 寡聚酶，全酶由10 种共22 个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。 P334 表 10-3 DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA 主要的酶，又称复制酶(Replicase) Pol.Ⅲ的5 ，→3 ，外切酶活性只作用于单链DNA。 P334 表 19-2 E.coli 三种DNA 聚合酶的性质比较 ★DNA聚合酶有6 个结合位点 ⑴ 模板 DNA 结合位点 ⑵ 引物结合位点 ⑶ 引物 3 ， -OH位点、反应位点 ⑷ 底物 dNTP 结合位点 ⑸ 5 ， → 3 ， 外切位点(pol.Ⅱ没有) ⑹ 3 ， → 5 ， 外切位点(校正) 5、 真核生物DNA聚合酶 P334 表 19-4 真核生物 DNA 聚合酶 真核 DNA 聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。 ⑴ DNA 聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA 复制酶。 ⑵ DNA 聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。 ⑶ DNA 聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA 的复制有关。 ⑷ DNA 聚合酶δ，特点：有3 ， → 5 ，外切活力。 （二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶） 细胞内，DNA的复制需要引物（DNA 或 RNA），引物酶或 RNA 聚合酶可合成 6-10 个碱基的 RNA 引
物 ★DNA复郜为什么要用RNA引物?(为什么DNA聚合要用物,RNA聚合醃不需要引物?) P338 ()从模板复制贔祝几个橉时,基埔集丿和踺都弱,易矬生铓配 2)新复袆的最初几个核苷酸,没有与模莫成定双链,DNA聚合酶的5·→3·校能发挥作用。 (三) 解螺旋酶 大肠杄菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rp蛋白共同作用,将DNA两条链解开 解螺旋酶Ⅰ、∏、Ⅲ沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动,而蛋白则在另一条模板链 上沿3’→5’方向移动。 (四)DNA旋转 属DNA拓扑异构酶∏,可引入负超螺旋,消除复制叉前进时带来的扭曲张力 拓扑异构酶分两类:I和Ⅱ,广泛存在于原核生物和真核生物。 拓扑异构酶Ⅰ使DNA的一条链发生断裂和再连接,反应无须供给能量,主要集中在活性转录区,与转 录有关。 拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接,当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染 色质骨架蛋白和核基质部,与复制有关。 单链DNA结合蛋白(SSB) 复制叉上的解螺旋酶,沿双链DNA前进,产生单链区,大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合,阻止 复性和保护单链DNA不被核酸酶降解 (六) DNA连接 ligase) 连接双链DNA上的切口 大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。 TADNA ligase即可连接粘性末端的DNA,又可连接平齐 末端的双链DNA E coli和其它细菌的 DNAligase以NAD为能源,动物胞和噬菌体 DNA ligase以ATP为能源。 (七)DNA复制的扑结构 P338-339
６ 物。 ★DNA 复制为什么要用RNA 引物？（为什么DNA 聚合酶要用引物，RNA 聚合酶不需要引物？） P338 ⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 ⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA 聚合酶的 5，→3，校对功能难发挥作用。 （三） 解螺旋酶 大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep 蛋白共同作用，将DNA两条链解开。 解螺旋酶I、II、III 沿着模板链的 5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而 rep 蛋白则在另一条模板链 上沿 3’→5’方向移动。 （四） DNA旋转酶 属 DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 拓扑异构酶分两类：I 和II，广泛存在于原核生物和真核生物。 拓扑异构酶 I 使 DNA 的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转 录有关。 拓扑异构酶Ⅱ使 DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP 供给能量。分布在染 色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。 （五） 单链 DNA结合蛋白（SSB） 复制叉上的解螺旋酶，沿双链 DNA 前进，产生单链区，大量的单链 DNA 结合蛋白与单链区结合，阻止 复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。 （六） DNA连接酶（ligase） 连接双链 DNA 上的切口。 大肠杆菌连接酶只能在模板上连接 DNA缺口。T4DNA ligase 即可连接粘性末端的 DNA，又可连接平齐 末端的双链DNA。 E.coli.和其它细菌的DNA ligase 以NAD为能源，动物细胞和噬菌体 DNA ligase 以ATP 为能源。 （七） DNA复制的拓扑结构 P338-339
四、DNA的半不连续复制 P336图1915DNA的半不连续复制 DNA聚合酶催化的方向是5→3。 前导链 滞后链 1968年,发现冈崎片段。长度: 细菌:1Kb-2Kb,相当于一个顺反子的大小 真核:100200bp,约等于一个核小体DNA的长度 五、DNA复过程( E coli) P342图1917大肠杆菌的复制体结构示意图 1、复制的起始 引发:当DNA的双螺旋解开后,合成RNA引物的过程。 引发体:引物合成酶与各种蛋白质因子(dnaB、dnaC、n、n'n’D)构成的复合体,负责RNA引物的 合成。 引发体沿着模板链5’→3′方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反,而与复制叉移动的方向相同), 移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 E colLINA复制原点onC,由245bp组成,三组13bp重复序列(近5端处),四组9bp重复序列(另 端处) 图 大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质: dNaA 在原点处打开双螺旋 DNaB 使DNA解旋 DNac DNaB结合在原点所需 刺激起始 引物酶(DNaG)合成RNA引物 结合单链DNA RNA聚合酶 促进DNaA活性 旋转酶 松驰DNA扭曲应力 20个DnaA结合在四组帅p重复区,形成起始复合物,DNA环绕此复合物。 三组13bp重复区依次变性,产生开放型复合物 DnaB(在DnaC协助下)与开放复合物结合,进一步解链。 7
７ 四、 DNA 的半不连续复制 P336 图 19-15 DNA 的半不连续复制 DNA 聚合酶催化的方向是5 ，→3 ，。 前导链： 滞后链： 1968 年，发现冈崎片段。长度： 细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。 真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA 的长度。 五、 DNA 复制过程（E.coli.） P342 图 19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图 1、 复制的起始 引发：当 DNA 的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。 引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）构成的复合体，负责 RNA 引物的 合成。 引发体沿着模板链 5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同）， 移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 E.coli.DNA 复制原点 ori C，由 245bp 组成，三组 13bp 重复序列（近 5 ，端处），四组 9 bp重复序列（另 一端处）。 图 大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质： DNaA 在原点处打开双螺旋 DNaB 使 DNA 解旋 DNaC DNaB 结合在原点所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成 RNA引物 SSB 结合单链DNA RNA 聚合酶 促进 DNaA 活性 旋转酶 松驰 DNA 扭曲应力 20 个 DnaA 结合在四组9bp 重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。 三组 13bp 重复区依次变性，产生开放型复合物。 DnaB（在DnaC 协助下）与开放复合物结合，进一步解链
2、DNA链的延长反应 前导链只需要一个RNA引物,后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物链的延长反应由 DNA pol Ⅲ催化 复制体:在DNA合成的生长点(既复制叉上)分布着许多与复制有关的酶和辅助因子,它们在DNA的 模板链形成离散的复合物,彼此配合进行髙度精确的复制,称为复制体。 复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA 3、RNA引物的切除及缺口补齐 DNA pol I的5→3外切活力,切除RNA引物。 DN Apol I的5→3合成活性补齐缺口 4、DNA切口的连接 DNA ligas,动物、真核由ATP供能,原核由NAD供能。 5、DNA合成的终止 环状DNA、线性DNA,复制叉相遇即终止。 ◆小结: (1)DNA解螺旋酶解开双链DNA。 (2)SSB结合于DNA单链 (3)DNA旋转酶引入负超螺旋,消除复制叉前进时带来的扭曲张力 (4)DNA引物酶在引发体中合成RNA引物 (5) DNApol III在两条新生链上合成DNA。 (6) DNA pol I切除RNA引物,并补上DNA (7) DNAligase连接一个冈崎片段。 DNA复袆过程中,聚合酶对dTP和dUP的分辨能力高有少量dUTP掺入DNA链中,此时,U-糖苷 酶、AP内切酶、 DNA pol I、 dNA ligas共同作用,切除尿嘧啶,接上正确的碱基。 六、真核生物DNA的复制P343 复制起点和单位 真核生物染色体DNA是多复制子,有多个复制起点,可以多点起始,分段进行复制。每个复制子大多 在10020bp之间,比细菌染色体DNA(单复制子)小得多。 ★试验证据:5-氟胞苷标己
８ 2、 DNA 链的延长反应 前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol. Ⅲ催化。 复制体：在 DNA 合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA 的 模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。 复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。 3、 RNA 引物的切除及缺口补齐 DNA polⅠ的5 ， → 3 ，外切活力，切除RNA引物。 DNApolⅠ的5 ， → 3 ，合成活性补齐缺口。 4、 DNA 切口的连接 DNA ligase，动物、真核由ATP 供能，原核由NAD 供能。 5、 DNA 合成的终止 环状 DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。 ◆ 小结： ⑴ DNA 解螺旋酶解开双链DNA。 ⑵ SSB 结合于 DNA 单链。 ⑶ DNA 旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 ⑷ DNA 引物酶(在引发体中)合成RNA引物。 ⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除RNA 引物，并补上DNA。 ⑺ DNA ligase 连接一个冈崎片段。 DNA复制过程中，聚合酶对dTTP 和dUTP 的分辨能力高,有少量dUTP 掺入 DNA 链中，此时，U-糖苷 酶、AP 内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase 共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。 六、 真核生物DNA的复制 P343 1、 复制起点和单位 真核生物染色体 DNA 是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多 在 100-200bp 之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。 ★试验证据：5-氟脱氧胞苷标记
真核生物NA复制叉移动的速度此原核的慢,如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟1-3Kb,细菌每分 钟 真核生物染色体全部复制完成前,起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中,起点可以连续 发动复制。真核生物在快速生长时,可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇,早期胚胎细胞中相邻复 制起点的平均距离为79kb,而在培养的成体细胞中,平均距离为4)kb,成体细胞只利用一部分复制起点 2、复制过程中组蛋白的配 核小体的结构(200bp左右) 在真核生物的复制子上,亲代染色体的核小体被逐个打开,组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代 DNA的前导链上,新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此,DNA的复制是半保留的,而组蛋白则是 全保留的。 ★试验证据:环己酾亚胺卬白合成,电子显微下观察 3、真核生物DNA复制的终止 端粒:一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体,是真核细胞染色体末端所特有的结构。 功能 (1)保证线性DNA的完整复制 (2)保护染色体末端 (3)决定细胞寿命,胚系细胞含端粒酶,体细胞不表达端粒酶。 端粒( telomeres)分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列,式为:5(TxGy)n3 (AxCy)n,x和y一般为1-4。 端粒末端的重复序列,通过端粒酶(ε elomerase)将其加到染色体末端 端粒酶含有RNA和蛋白质(起DNA聚合酶的作用)两种组分,RNA分子约159b,含有多个CyAx重 复序列,RNA分子用作端粒TGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶,它只合成与酶自身的RNA模板 互补的DNA片段 人类体细胞的端粒长度,随个体年龄増加而逐渐缩短。细胞每分裂次,端粒缩短50200bp,短至1-Kbp 时,细胞就停止分裂。若能重建端粒,则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多 (1)杂交 图 (2)聚合 图 (3转位再杂交 图 (4)进一步聚合
９ 真核生物 DNA 复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟 1-3Kb，细菌每分 钟 5Kb。 真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续 发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复 制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。 2、 复制过程中组蛋白的装配 核小体的结构（200bp 左右） 在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代 DNA 的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA 的复制是半保留的，而组蛋白则是 全保留的。 ★试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察 3、 真核生物DNA复制的终止 端粒：一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。 功能： ⑴保证线性DNA的完整复制 ⑵保护染色体末端 ⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。 端粒（telomeres）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约 100bp 的重复序列，形式为：5 ，（TxGy）n3， (AxCy)n，x 和y 一般为1—4。 端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。 端粒酶含有 RNA 和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA 分子约 159b，含有多个 CyAx 重 复序列，RNA 分子用作端粒 TxGy 链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板 互补的 DNA片段。 人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至 1-4Kbp 时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。 ⑴杂交 图 ⑵聚合 图 ⑶转位再杂交 图 ⑷进一步聚合
图 (5)非标准GG配对 图 七DNA复制的调控 八、DNA复制的真实性 《杨岐生》P144 生物体DNA复制具有高度真实性,复制103-10u碱基对只有一个错误碱基。 碱基对的自由能通常在413KJmo,这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配, 仅靠 Watson-Crik双螺旋的碱基配对原则,突变率将髙达10 l、DNA聚合酶对碱基的选择侑用 酶的被动论:不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同,正确的dNIP能长时间停留,而参与聚合。DNA 聚合酶能依照模板的核苷酸,选择正确的dNP掺入引物末端 酶积极参与理论:DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸,不仅亲和性不同,而且将它们插入DNA引物端 的速度也不同。 动力学校阅读:在新的磷酸二酯键未形成时,dNTP结合在酶与模板一引物复合物的聚合位点上,DNA 聚合酶能识别正确与错误的dNIP。 DNA聚合酶对底物的识别作用,DNA聚合酶有两种底物,一种是DNA模板一引物,另一种是dNIP。 DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3未端,再识别底物dNIP,是一种有序的识别过程。 2、3'→5外切活性的校正阅读 E.· coli DNApol.I和polⅢ有3→5外切活性,可删除错误插入的核苷酸 缺失3→5外切活性的E∞ coli DNA pol I,催化DNA合成时,出现错误的几率增高550倍。因此,3 5外切活性可以使DNA复制的真实性,提高1-2个数量级。 图 3、影响DNA合成真实性的因素 (1)高浓度MMP如3AMP5AGMP) NMP竞争酶的dNTP结合位点,抑制3→5外切活性。 (2)某一种dNTP浓度银高可使引物3末端离开外切活性中 (3入NIP一般与二价阳离子结合成活化形式,Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子(如 Mn2+)代替Mg2咐时,会改变酶的主体结构,影响聚合活性和3→3外切活性
１０ 图 ⑸非标准 GG 配对 图 七、 DNA 复制的调控 八、 DNA 复制的真实性 《杨岐生》P144 生物体 DNA复制具有高度真实性，复制107 -1011碱基对,只有一个错误碱基。 碱基对的自由能通常在 4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入 100个核苷酸就可能出现一次错配， 仅靠 Watson-Crick 双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2 。 1、 DNA 聚合酶对碱基的选择作用 酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP 能长时间停留，而参与聚合。DNA 聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP 掺入引物末端。 酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA 引物端 的速度也不同。 动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP 结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA 聚合酶能识别正确与错误的dNTP。 DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是 DNA 模板—引物，另一种是dNTP。 DNA 聚合酶先识别 DNA 模板和引物的3 ，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。 2、 3 ，→5 ，外切活性的校正阅读 E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3 ，→5 ，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。 缺失 3 ， →5 ，外切活性的 E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化 DNA合成时，出现错误的几率增高 5-50 倍。因此，3 ， →5 ，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2 个数量级。 图 3、 影响 DNA合成真实性的因素 ⑴高浓度 NMP(如 3 ， -AMP, 5 ， -GMP) NMP 竞争酶的dNTP 结合位点，抑制3 ，→5 ，外切活性。 ⑵某一种 dNTP 浓度银高,可使引物3 ，末端离开外切活性中心。 ⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg 2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如 Mn 2+）代替 Mg 2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3 ，→3 ，外切活性