第四章酶的纯化和精制 第一节纯化方案设计 第二节纯化方法 ●第三节酶的纯度和产量 ●第四节酶的剂型与保存
第四章 酶的纯化和精制 第一节 纯化方案设计 第二节 纯化方法 第三节 酶的纯度和产量 第四节 酶的剂型与保存
第一节纯化方案设计 分离纯化酶的原则 设计酶的纯化方案时要考虑到应用,下列各点 是应认真遵循的原则 第一,要注意防止酶变性失效,这一点在纯化 的后期更为突出。 第二,从理论上说,凡是用于蛋白质分离纯化 的一切方法都同样适用于酶。 第三,酶具有催化活性,检测鸸活性可以跟踪 酶的来龙去脉,为酶的抽提、纯化以及制剂过程 中选择适当的方法与条件提供直接的依据
第一节 纯化方案设计 一.分离纯化酶的原则： 设计酶的纯化方案时要考虑到应用，下列各点 是应认真遵循的原则： 第一，要注意防止酶变性失效，这一点在纯化 的后期更为突出。 第二，从理论上说，凡是用于蛋白质分离纯化 的一切方法都同样适用于酶。 第三，酶具有催化活性，检测酶活性可以跟踪 酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程 中选择适当的方法与条件提供直接的依据
二防止酶变性失效的方法 (1)除了少数例外,所有操作都应在低温条件下 进行,尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别 小心。 (2)大多数酶在pH10的情况下不稳 定故必须控制整个系统不要过酸过碱;同时要 避免在调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 (3)酶和其它蛋白一样,常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性,故操作中应尽量减少泡沫形 成 (4)重金属等匍引起酶失效,有机溶剂能使醃变 性微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分 解破坏,所有这些也都应予以定够的重视。一
二.防止酶变性失效的方法: (1)除了少数例外，所有操作都应在低温条件下 进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别 小心。 (2)大多数酶在pH10的情况下不稳 定，故必须控制整个系统不要过酸过碱；同时要 避免在调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 (3)酶和其它蛋白一样，常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形 成。 (4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变 性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分 解破坏，所有这些也都应予以足够的重视
整个纯化工作包括三个基本环节:抽提、纯化 和精制。 ●常用的抽提方法除细胞自溶外,还有有机溶剂 或表面活性剂处理等化学方法;近年来为适应 日益增多的胞內酶分离提纯的需要,发展和设 计了不少细胞或菌体的破碎设备,如超声波振 荡器、高压喷挤设备、匀浆裝置及振动球磨
整个纯化工作包括三个基本环节：抽提、纯化 和精制。 常用的抽提方法除细胞自溶外，还有有机溶剂 或表面活性剂处理等化学方法；近年来为适应 日益增多的胞内酶分离提纯的需要，发展和设 计了不少细胞或菌体的破碎设备，如超声波振 荡器、高压喷挤设备、匀浆装置及振动球磨
第二节纯化方法 酶分离纯化王作是酶学研究的重要组成部分,亦是 酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个酶,就 得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本质是蛋白质 所以用于蛋白质的分离纯化方法一般都适用于酶的分 离纯化。此外,酶是具有催化功能的蛋白质,因此根据 酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特 异亲合力,可发展酶独特的亲合色谱技术。所有的分离 纯化方法,都是根据被分离物质间不同的物理、化学和 生物学性质的差异而设计出来的。分离纯化生物大分子 的方法很多,主要是利用它们之间特异性的差异:如分 子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷及对其他 分子的亲和性等建立起来的。如果欲分离的目标分子是 细胞內产物,首先涉及的是细胞的破碎。接下来的分离 过程可分成粗分烹和精制分离
第二节 纯化方法 酶分离纯化工作是酶学研究的重要组成部分，亦是 酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个酶，就 得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本质是蛋白质 ，所以用于蛋白质的分离纯化方法一般都适用于酶的分 离纯化。此外，酶是具有催化功能的蛋白质，因此根据 酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特 异亲合力，可发展酶独特的亲合色谱技术。所有的分离 纯化方法，都是根据被分离物质间不同的物理、化学和 生物学性质的差异而设计出来的。分离纯化生物大分子 的方法很多，主要是利用它们之间特异性的差异：如分 子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷及对其他 分子的亲和性等建立起来的。如果欲分离的目标分子是 细胞内产物，首先涉及的是细胞的破碎。接下来的分离 过程可分成粗分离和精制分离
酶的抽提 ●抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质 从原料引入溶液。 1.预处理 过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来 源,近年来则主要采用微生物作材料。但是不 管什么原料,通常都需要先进行适当的预处理。 例如,动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织 油质种子最好先用乙醚等脱脂;种孑硏磨前应 去壳,以免丹宁等物质着色污染;微生物材料 则应将菌体和发酵介质分离。经过这些处理后 材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用,否 则就应将完整材料立即冰冻起来
一.酶的抽提 抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质 从原料引入溶液。 1. 预处理 过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来 源，近年来则主要采用微生物作材料。但是不 管什么原料，通常都需要先进行适当的预处理。 例如，动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织； 油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应 去壳，以免丹宁等物质着色污染；微生物材料 则应将菌体和发酵介质分离。经过这些处理后， 材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用，否 则就应将完整材料立即冰冻起来
2.破细胞 酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外 酶/根据它的存在状态,即是否与细胞内的 颗粒体或膜结合,细胞内酶又可分为结酶与 溶酶。细胞外酶没有破细胞问题;但是细胞 内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来,而 且抽提效果也往往与细胞破碎程度有关。至 于结酶,还有—个切断它与颗粒体或膜的连 结问题
2. 破细胞 酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外 酶，根据它的存在状态，即是否与细胞内的 颗粒体或膜结合，细胞内酶又可分为结酶与 溶酶。细胞外酶没有破细胞问题；但是细胞 内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而 且抽提效果也往往与细胞破碎程度有关。至 于结酶，还有一个切断它与颗粒体或膜的连 结问题
2.1丙酮干粉法:一般是先将材料粉碎或分散 然后在0℃以下的低温条件下加入5-10倍的 15~20°的丙酮,迅速搅拌均匀,随即过滤, 最后低温干燥研磨过筛。 优点:丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁 (膜)另一方面由于丙酮是脂溶剂,这种处理有 利于除去大量脂类物质,以免它在以后的步骤 生干扰,有时这种处理还能使某些结酶易于 溶解;此外,丙酮干粉含水量低,易于保存. 缺点:丙酮可能引起某些酶变性失效,有些酶 则根本不能采用此法
2.1丙酮干粉法：一般是先将材料粉碎或分散， 然后在0℃以下的低温条件下,加入5—10倍的 15～20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤， 最后低温干燥,研磨过筛。 优点：丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁 (膜);另一方面由于丙酮是脂溶剂，这种处理有 利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤 产生干扰，有时这种处理还能使某些结酶易于 溶解；此外，丙酮干粉含水量低，易于保存. 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶 则根本不能采用此法
22自溶法就是在适当的温度、pH条件下, 将浓的菌体悬破直接保温,或加甲苯乙酸 乙酯或其它溶剂一起保温一定时间,使菌体 自溶液化。 缺点:第一,自溶液中成份十分复杂。 第二,有破坏待分离酶的危险
2.2自溶法:就是在适当的温度、pH条件下， 将浓的菌体悬破直接保温，或加甲苯、乙酸 乙酯或其它溶剂一起保温一定时间，使菌体 自溶液化。 缺点：第一，自溶液中成份十分复杂。 第二，有破坏待分离酶的危险
23破细胞的手段 动、植物材料 通常用绞肉机作成组织糜,如果需要破碎得更彻 底些可用高速组织捣碎器捣碎,或者加砂研磨。 高速捣碎器操作简便、破碎效果好,但易引起局 部温度过高,导致酶失效,故必须考虑酶的特点 谨慎使用。加砂硏磨,特别是用玻璃粉或氧化铝 代替砂时,要注意有时可能发生吸附变性。在上 述机械处理后,为了有利于下一步抽提,还可进 步作成丙酮千粉,或者进行反复冰冻融解处理 量少时,某些组织还可采用匀浆器将细胞研磨破 碎
2.3 破细胞的手段： 动、植物材料： 通常用绞肉机作成组织糜，如果需要破碎得更彻 底些，可用高速组织捣碎器捣碎，或者加砂研磨。 高速捣碎器操作简便、破碎效果好，但易引起局 部温度过高，导致酶失效，故必须考虑酶的特点 谨慎使用。加砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝 代替砂时，要注意有时可能发生吸附变性。在上 述机械处理后，为了有利于下一步抽提，还可进 一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻融解处理， 量少时，某些组织还可采用匀浆器将细胞研磨破 碎