第八章王要酶的制备和测定 d-淀粉酶 果胶酶 ●/B-淀粉酶 s脂肪酶 糖化酶 乳糖酶 ●蛋白酶 ●超氧化物歧化酶 ●纤维素酶
第八章 主要酶的制备和测定 α-淀粉酶 β-淀粉酶 糖化酶 蛋白酶 纤维素酶 果胶酶 脂肪酶 乳糖酶 超氧化物歧化酶
第一节α-淀粉酶 Q-淀粉酶的特征 ●α-淀粉酶系统命名为α-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶 EC.321.1),作用与淀粉与糖原时,从底物分子 内部不规则的切开α-1,4键,而生成麦芽糖、少量 葡萄糖与一系列分子量不等的低聚糖和糊精。α-淀 粉酶是一种金属酶,每个酶分子至少含一个钙离子 多的可以达到10个钙离子,钙维持酶分子的最大活 性与稳定性。 α-淀粉酶的品种及其性质 ●1枯草杄菌类α-淀粉酶 2霉菌类α-淀粉酶 3动植物类α-淀粉酶 ●4耐热性α淀粉酶 ●5酸性α-淀粉酧和碱性α-淀粉酶
第一节α-淀粉酶 一.α-淀粉酶的特征 α-淀粉酶系统命名为α-1，4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶 （EC.3.2.1.1），作用与淀粉与糖原时，从底物分子 内部不规则的切开α-1，4 键，而生成麦芽糖、少量 葡萄糖与一系列分子量不等的低聚糖和糊精。α-淀 粉酶是一种金属酶，每个酶分子至少含一个钙离子， 多的可以达到10个钙离子，钙维持酶分子的最大活 性与稳定性。 二.α-淀粉酶的品种及其性质 1 枯草杆菌类α-淀粉酶 2 霉菌类α-淀粉酶 3 动植物类α-淀粉酶 4 耐热性α-淀粉酶 5 酸性α-淀粉酶和碱性α-淀粉酶
直链淀粉 o葡萄糖残基 ●还原末端葡萄糖残基 x-1.4-糖苷键 1.6-糖苷镁 β-界限糊精 a-淀粉藤 淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 异淀粉酶 支链淀粉 图8-1淀粉的结构与各种淀粉酶作用型式
三.α-淀粉酶的工业生产 工业生产用的菌种有枯草杆菌BF-7658和米曲霉602, 前者用液体深层发酵,后者适用固体发酵。 ●1固体发酵 (1)流程斜面菌种三角瓶种子种曲厚层通风发酵 ●发酵烘千粗制品抽提过滤沉淀过滤烘干精制品 2)米曲霉602和2120生产药用α淀粉酶 ●2液体深层发酵(BF7658 3高温酶的生产 ●四.α淀粉酶活力的测定(液化型淀粉酶) 1原理是应用消色法测定酶活力。淀粉被液化型淀粉 酶水解(液化),切断淀粉链的α-1、4糖苷键。对碘呈 蓝紫色的反应逐渐消失。这种呈色消逝的速度可以表示 液化的程度,因而能测定酶的活力
三. α-淀粉酶的工业生产 工业生产用的菌种有枯草杆菌BF-7658和米曲霉602， 前者用液体深层发酵，后者适用固体发酵。 1.固体发酵 （1）流程 斜面菌种三角瓶种子种曲厚层通风发酵 发酵烘干粗制品抽提过滤沉淀过滤烘干精制品 （2）米曲霉602和2120生产药用α-淀粉酶 2．液体深层发酵(BF—7658) 3.高温酶的生产 四. α-淀粉酶活力的测定（液化型淀粉酶） 1.原理 是应用消色法测定酶活力。淀粉被液化型淀粉 酶水解(液化），切断淀粉链的α-1、4糖苷键。对碘呈 蓝紫色的反应逐渐消失。这种呈色消逝的速度可以表示 液化的程度，因而能测定酶的活力
●2.试剂 ●团碘液:称取碘11g,碘化钾2加水溶解,定容至 500mL。 标淮稀碘液:取碘原液15mL、加碘化钾8g用水定容 到200mL。 2%可溶性淀粉:称取干可溶性淀粉29,先以少许 蒸馏水混和,再徐徐倾入煮沸蒸馏水中,继续煮沸2 分钟,冷却.加水到100ml。 pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 比色稀碘液:取碘原液2mL.加碘化钾20g,用水定 容到500mL。 标准糊精液:称0.39纯糊精,悬浮于少量水中,再 倾于400mL沸水中,冷却后加水稀释到500mL
2．试剂 团碘液：称取碘11g，碘化钾22g加水溶解，定容至 500mL。 标淮稀碘液：取碘原液15mL，加碘化钾8g用水定容 到200mL。 2％可溶性淀粉：称取干可溶性淀粉2g，先以少许 蒸馏水混和，再徐徐倾入煮沸蒸馏水中．继续煮沸2 分钟，冷却．加水到100mI。 pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 比色稀碘液：取碘原液2mL．加碘化钾20g，用水定 容到500mL。 标准糊精液：称0.3g纯糊精，悬浮于少量水中，再 倾于400mL沸水中，冷却后加水稀释到500mL
3测定方法 取mL标准糊精液置于盛有3η标准稀碘液的试管 中.作为比较颜色的标准管。 在25×200mm的试管中.加入2%可溶性淀粉溶液 20mL,在60℃水浴中平衡温度45分钟,加入5mL 酶液,充分混合,立即记时.定时取出一滴反应液于比 色板穴内,穴中先盛有比色稀碘波,当紫色逐渐转变为 棕澄色,与标准比色管园色相同时即为反应终点,记录 时间即为液化时间 4计算 ●液化型淀粉酶活力单位定义:1g酶粉,在60°C,pH值为 6.0,1h液化可溶性淀粉的克数:每小时酶促液化1g淀 粉的酶量为一个酶的活力单位 60 液化型淀粉藤活力(D)=(×20×2%×÷0.5 60℃ 48
3.测定方法 取lmL标准糊精液置于盛有3mI标准稀碘液的试管 中．作为比较颜色的标准管。 在25×200mm的试管中．加入2％可溶性淀粉溶液 20mL．在60℃水浴中平衡温度4—5分钟，加入o.5mL 酶液．充分混合，立即记时．定时取出一滴反应液于比 色板穴内，穴中先盛有比色稀碘波，当紫色逐渐转变为 棕澄色，与标准比色管园色相同时即为反应终点，记录 时间即为液化时间。 4.计算 液化型淀粉酶活力单位定义：1g酶粉，在60℃，pH值为 6.0，1h液化可溶性淀粉的克数：每小时酶促液化1g淀 粉的酶量为一个酶的活力单位
第二节β淀粉酶 ●一.β-淀粉酶特征 ●该酶可以从淀粉分子非还原性末端依次水解α1,4键 不能切开α-1,6键,故水解支链淀粉是不完全的,在 达到分枝点前2~3个葡萄糖残基时就停止不前.而残留 大分子的界限糊精,生成的麦芽糖至多只有50% 60%。作用于淀粉时粘度不易下降,糊精化慢。与碘 的呈色反应只能由深蓝变浅,而不会变为紫、红和无 色。由于该酶作用于底物时,会发生沃尔登转位反应 使产物由α-型变为β-型麦芽糖,因此被称为β-淀粉 酶 β-淀粉酶性质 些植物的β-淀粉酶最适pH是5.0~6:.0,微生物β 淀粉酶最适pH是6.0~7.0。pH稳定范围:植物的为 50~80,微生物的为40~90 ●对热的稳定性因酶源不同而有差别。如大麦的β-淀粉
第二节β-淀粉酶 一.β-淀粉酶特征 该酶可以从淀粉分子非还原性末端依次水解α- 1，4键， 不能切开α- 1，6键，故水解支链淀粉是不完全的，在 达到分枝点前2~3个葡萄糖残基时就停止不前．而残留 下大分子的界限糊精，生成的麦芽糖至多只有50％ ~60％。作用于淀粉时粘度不易下降，糊精化慢。与碘 的呈色反应只能由深蓝变浅，而不会变为紫、红和无 色。由于该酶作用于底物时，会发生沃尔登转位反应， 使产物由α-型变为β-型麦芽糖，因此被称为β-淀粉 酶。 二.β-淀粉酶性质 一些植物的β-淀粉酶最适pH是5.0~6.0，微生物β- 淀粉酶最适pH是6.0~7.0。pH稳定范围：植物的为 5.0~8.0，微生物的为4.0~9.0。 对热的稳定性因酶源不同而有差别。如大麦的β-淀粉 酶在pH5.5、65℃水解30min 损失50％，70℃水解
失活。同样条件下,山芋粗酶在60-65°C时不失活。大麦 的β-淀粉酶在室温和pH4.5时酶活最高而且稳定。微生 物β-淀粉酶耐热性差,一般在35~50℃。 钙离子对β-淀粉酶有降低稳定性作用 三.β淀粉酶的生产 植物来源的β-淀粉酶耐热性较微生物来源的酶高,工 业上使用来自山芋、麦芽、大豆的酶生产麦芽糖。麦麸 以1:5的加水比,在pH6,温度45℃C浸泡1h,沉渣可作 饲料.上清液以硫酸铵盐析沉淀,后道工序与微生物酶 的提取一样,经干燥获得成品酶。 四.用途 ●1.用于生产麦芽糖 ●2.用于啤酒生产外加酶糖化
失活。同样条件下，山芋粗酶在60~65℃时不失活。大麦 的β-淀粉酶在室温和pH4.5时酶活最高而且稳定。微生 物β-淀粉酶耐热性差，一般在35~50℃。 钙离子对β-淀粉酶有降低稳定性作用。 三.β-淀粉酶的生产 植物来源的β-淀粉酶耐热性较微生物来源的酶高，工 业上使用来自山芋、麦芽、大豆的酶生产麦芽糖。麦麸 以1：5的加水比，在pH6，温度45℃浸泡1h，沉渣可作 饲料．上清液以硫酸铵盐析沉淀，后道工序与微生物酶 的提取一样，经干燥获得成品酶。 四.用途 1.用于生产麦芽糖 2.用于啤酒生产外加酶糖化
88三种微生物产生的淀粉聊性质 项目 B. carets B polymer C. thermosul-furogens 分于量 6,4X107,0,5.8,4.2×101 5。5X104 最适pH 7.0 7.5 5,5 最适温度 40 45 等电点 35,8,59 K。可溶性淀粉0.4mg/mL 0.071mg/mL 6. 68mg/mL Cy残基数 PcMB抑 十
●五活力测定 ●1.麦芽糖标准曲线制作 取25m比色管5支,按下表顺序加入0.3%麦芽糖溶 液、水及3,5硝基水杨酸试剂DNS试剂)混和均 匀后在沸水浴中加热5min,取出立即冷水冷却,用蒸 馏水稀释至25mL.摇匀。用分光光度计测定540nm处 的光密度OD值)。以麦芽糖含量(mg)为横坐标.OD 值为纵坐标,作标准曲线 2.酶样液 酶粉用少量水溶解,移入合适容量的容量瓶中。如 此重复。加水至刻度,混匀,用四层纱布过滤,取清 液备用。 ●3.测定 向试管中加入mnL2%可溶性淀粉和1mL0.1moⅥ的 PH58的柠檬酸—僯酸盐缓冲液。于40°℃水浴保温3
五.活力测定 1.麦芽糖标准曲线制作 取25mL比色管5支，按下表顺序加入0.3％麦芽糖溶 液、水及3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)，混和均 匀后在沸水浴中加热5min，取出立即冷水冷却，用蒸 馏水稀释至25mL．摇匀。用分光光度计测定540nm处 的光密度(OD值)。以麦芽糖含量(mg)为横坐标．OD 值为纵坐标，作标准曲线。 2．酶样液 酶粉用少量水溶解，移入合适容量的容量瓶中。如 此重复。加水至刻度，混匀，用四层纱布过滤，取清 液备用。 3．测定 向试管中加入lmL2％可溶性淀粉和1mL0.1mol/l的 PH5.8的柠檬酸—磷酸盐缓冲液。于40℃水浴保温3