图 有色 Edman法 荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理: Edman法,可测60肽。 1967液相测序仪 自旋反应器,适于大肽段。 1971固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦连肽段的C端。 1981气相测序仪 用 Polybrene反应器 (聚阳离子)四级铵盐聚合物 液相:5nmol20-40肽97% 气相:5pmol 肽 肽段拼接成肽链 16肽,N端HC端 A法裂解: ONS PS EOVE RLA HOWT B法裂解: SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列: HOW TONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定(双向电泳法) 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化一S—S—生成-SOH 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽,测 与拼接出的肽链比较,定出二硫键的位置 酰胺的确定 酶解肽链,产生含单个Asx或Glx的肽,用电泳法确定是Asp还是Asn 举例:Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时,电荷量是Leu'Pro°al 此肽除Glx外,净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接,-N-糖苷-0-糖苷 脂类:Ser、Thr、Cys 磷酸:Ser、Thr、His 经验性序列:Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO)图 有色 Edman 法 荧光基团或有色试剂标记的 PITC 试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman 法，可测 60 肽。 1967 液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。 1971 固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981 气相测序仪 用 Polybrene 反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40 肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98% 肽段拼接成肽链 16 肽，Ｎ端 H Ｃ端Ｓ Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定（双向电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 酰胺的确定 Asp –Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个 Asx 或 Glx 的肽，用电泳法确定是 Asp 还是 Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val 肽在 pH=6.0 时，电荷量是 Leu + Pro0 Val- 此肽除 Glx 外，净电荷为 0，可根据此肽的电泳行为确定是 Glu 或是 Gln。 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过 Asn、Ser 与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷 脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)