国外多以该法测定SOD活性。在SOD被发现之初就是利用此法进行测定的,又称之为 Mccord法, 被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为:在一定条件下,3ml反应液中,每分钟抑制氧化型细 胞色素C还原率达50%的酶量定为一个活力单位 McCord法灵敏度较低,但采取以下措施可得到提高 ①用乙酰化细胞色素C替代细胞色素C,可将灵敏度提高一倍,而且使测定结果不受样品中细胞色素 C氧化酶的影响 ②将pH7.8,o.05mol/磷酸缓冲液换成pH102的碳酸缓冲液,并将黄嘌呤浓度从0.05 mmol/L增至 0.10mmol/L,灵敏度可提高10倍 ③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10分钟,使O2ˉ·产量达到稳定程度,即O2ˉ· 生率与其自动歧化率达到平衡,灵敏度增加可高达710倍 ④利用FP9平行分析仪可进行半自动分析,快速、简便,可以同时测定多个样品。 (2)邻苯三酚自氧化法 国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法(简称 Marklund法), Marklund法是采用420nm处光吸收测定。 酶活力定义为:在一定条件下1m的反应液中,每分钟控制邻苯三酚在420nm波长的自氧化速率达50% 的酶量定为一个活力单位。 该方法经过不断改进,操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由420nm改用325nm,测试灵敏度 提高了64倍,称为微量邻苯三酚自氧化法,同时将邻苯三酚耗量减少一半; Marklund法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行,因此样品池必须保持恒温,且不 能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇(DIT)或L-抗坏血酸(VC)作为终止剂,使反应暂时停止, 使A420在一定时间内保持恒定,可同时测多个样品,有较高的重复性和回收率。同时,终止剂既不参与, 也不影响邻苯三酚的呈色反应,自氧化曲线与经典法的相吻合,最大抑制百分比和灵敏度也基本一致 另外,为消除HCl对SOD的抑制作用,改用K2HPO4-KH2PO4缓冲液替代Tris-H1缓冲液,灵敏度 可提高50 (3)化学发光法 化学发光法依据的原理是:O2·可与化学发光剂鲁米诺( luminol)反应,产生激发态产物,当其迅 速返回基态时,即发出光。SOD可消除O2-·从而使发光强度降低,SOD浓度与发光百分率在一定时间 内呈线性关系。活力单位定义为:在一定条件下,使每毫升反应液于1分钟末发光率被抑制50%的酶量作 为一个酶活力 同传统的比色法相比较,化学发光法专一性较强,其他干扰因素少,灵敏度高,最适用作粗提取液中 SOD活性的检测。 (4)极谱氧电极法 比色法测定的呈色反应往往不稳定,因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生O2·过 程中消耗O2,一定量的SOD又会使O2ˉ·歧化产生O2,从而使耗氧量减少的特性,使用极谱氧电极仪精 确测出耗氧量而推算出酶活。SOD活力单位定义为:25℃,pH8.4,使每分钟产生1μlO2的SOD量定为 1个酶活力单位。 该方法利用了O2张力的变化,与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无 关,尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定O2量,方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好 且可自动连续记录酶作用过程的变化。 除了以上几种方法,其他方法如光化学法(正染法)等方法也都得到不断的改进:而灵敏度、特异性 均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用,并取得了很好效果。同时计算机也开始用于SOD的活 性分析,并有用于SOD酶活力线性分析的专用软件,可适用于各种产O2-·系统、各种清除剂系统及不同 的酶提取液的活力测定 (二)过氧化氢藤( catalase,CAT) 过氧化氢酶是另一种酶类清除剂,又称为触酶,是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使HO2分解为分 子氧和水,清除体内的过氧化氢,从而使细胞免于遭受H2O2的毒害,是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是HO2的歧化,必须有两个HO先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上,才能9 国外多以该法测定 SOD 活性。在 SOD 被发现之初就是利用此法进行测定的，又称之为 McCord 法， 被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为：在一定条件下，3ml 反应液中，每分钟抑制氧化型细 胞色素 C 还原率达 50%的酶量定为一个活力单位。 McCord 法灵敏度较低，但采取以下措施可得到提高: ①用乙酰化细胞色素 C 替代细胞色素 C，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素 C 氧化酶的影响； ②将 pH7.8，0.05mo1/L 磷酸缓冲液换成 pH10.2 的碳酸缓冲液，并将黄嘌呤浓度从 0.05 mmo1/L 增至 0.10 mmo1/L ，灵敏度可提高 10 倍； ③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在 25℃下保温 10 分钟，使 O2 －·产量达到稳定程度，即 O2 －·产 生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达 710 倍； ④利用 FP9 平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。 （2）邻苯三酚自氧化法 国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法（简称 Marklund 法），Marklund 法是采用 420nm 处光吸收测定。 酶活力定义为：在一定条件下 1ml 的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在 420nm 波长的自氧化速率达 50% 的酶量定为一个活力单位。 该方法经过不断改进，操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由 420nm 改用 325nm，测试灵敏度 提高了 6.4 倍，称为微量邻苯三酚自氧化法，同时将邻苯三酚耗量减少一半； Marklund 法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行，因此样品池必须保持恒温，且不 能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇（DTT）或 L-抗坏血酸（VC ）作为终止剂，使反应暂时停止， 使 A420 在一定时间内保持恒定，可同时测多个样品，有较高的重复性和回收率。同时，终止剂既不参与， 也不影响邻苯三酚的呈色反应，自氧化曲线与经典法的相吻合，最大抑制百分比和灵敏度也基本一致。 另外，为消除 HCl 对 SOD 的抑制作用，改用 K2HPO4- KH2PO4 缓冲液替代 Tris - HCl 缓冲液，灵敏度 可提高 50%。 （3）化学发光法 化学发光法依据的原理是：O2 －·可与化学发光剂鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅 速返回基态时，即发出光。SOD 可消除 O2 －·，从而使发光强度降低，SOD 浓度与发光百分率在一定时间 内呈线性关系。活力单位定义为：在一定条件下，使每毫升反应液于 1 分钟末发光率被抑制 50%的酶量作 为一个酶活力。 同传统的比色法相比较，化学发光法专一性较强，其他干扰因素少，灵敏度高，最适用作粗提取液中 SOD 活性的检测。 （4）极谱氧电极法 比色法测定的呈色反应往往不稳定，因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生 O2 －·过 程中消耗 O2，一定量的 SOD 又会使 O2 －·歧化产生 O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精 确测出耗氧量而推算出酶活。SOD 活力单位定义为：25℃， pH8.4，使每分钟产生 1μl O2的 SOD 量定为 1 个酶活力单位。 该方法利用了 O2 张力的变化，与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无 关，尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定 O2 量，方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好， 且可自动连续记录酶作用过程的变化。 除了以上几种方法，其他方法如光化学法（正染法）等方法也都得到不断的改进；而灵敏度、特异性 均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用，并取得了很好效果。同时计算机也开始用于 SOD 的活 性分析，并有用于 SOD 酶活力线性分析的专用软件，可适用于各种产 O2 －·系统、各种清除剂系统及不同 的酶提取液的活力测定。 （二）过氧化氢酶（catalase，CAT） 过氧化氢酶是另一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使 H2O2 分解为分 子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受 H2O2 的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是 H2O2 的歧化，必须有两个 H2O2 先后与 CAT 相遇且碰撞在活性中心上，才能