都由9个相等亚基组成,其分子量为80000。因此,透皮或透膜吸收困难,体内或细胞内作用弱 (4)酶制剂不宜口服,口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏,且SOD分子原形不易透 过肠粘膜,因而难以发挥全身性药效作用 (5)大分子异性蛋白,不宜大剂量、长时间使用,否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应,呈 现明显的不良反应性变化 (6)对靶细胞或靶部位的亲和力低,药用趋向性不明显。因此,对疾病的疗效缺乏特异性作用 (7)酶的稳定性不高,对理化因素较为敏感,过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸 碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致SOD分子结构改变,酶活性丧失,形成不可逆性变化 (8)药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳 针对SOD应用过程中客观存在的局限性,国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作,并已逐步探 索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策 4.SOD的制备 SOD广泛存在于动、植物和微生物体内,但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限 制,影响了SOD的生产成本和推广应用 由于利用微生物(深红酵母)生产SOD具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限 制等优越性,因此,微生物SOD的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下 菌体培养→破壁→菌体破片→Rnasε酶解、离心30分钟 清液→上DE32柱→02mol/L NaCl洗脱 洗脱液→加45%(NH4)2SO4、离心→上清液亠上DE32柱→洗脱→洗脱 液→浓缩→冷冻干燥→SOD成品。 破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的硏究 表明,用甲苯法破壁对提取酵母SOD具有一定的优越性。另外,为了提高SOD纯度,在洗脱时可采用梯 度洗脱法 5.SOD的纯度检查 SOD产品一般为浅绿色冻干粉,其纯度的检查主要根据以下三个指标 (1)均一性 通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检査其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳,其操作简单,试剂单一且色带的 间隔比前者大,更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。 (2)酶的比活 要求达到一定的标准。如:化妆品用SOD比活≥3000mg蛋白质;口服用SOD比活≥3500umg蛋 白质;标准(活性测定用)及药用SOD比活≥5000mg蛋白质;试剂用SOD(电泳纯)比活≥800mng 蛋白质 (3)酶的重要理化性质 最重要的是金属离子含量(常采用原子吸收分光光度法测定)氨基酸含量和吸收光谱。如Cun-SOD 中1分子的酶必须含有相当于两原子Cu和两原子Zn;虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致,但仍 然显示一定的规律;三种SOD都有特定的吸收光谱,观察纯酶的吸收光谱有助于判断SOD的纯度。 6.SOD的(活性测定)分析方法 一般分为直接法和间接法两大类 直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器,在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生 剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚 及近年发展起来的非酶体系的NADH-PMS、核黄素- TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050:清除指示剂 则有最早发现的细胞色素C、NBT,到近年来的鲁米诺和MIT等 间接法中比色法最为常用,如黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的 方法多年来不断得到改进,其灵敏度也不断得到提高。另外,近年来新建立了多种方法,如化学发光法、 光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高,受到人 们的青睐。 (1)黄嘌呤氧化酶(XO)-细胞色素C法8 都由 9 个相等亚基组成，其分子量为 80000。因此，透皮或透膜吸收困难，体内或细胞内作用弱； （4）酶制剂不宜口服，口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏，且 SOD 分子原形不易透 过肠粘膜，因而难以发挥全身性药效作用； （5）大分子异性蛋白，不宜大剂量、长时间使用，否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应，呈 现明显的不良反应性变化； （6）对靶细胞或靶部位的亲和力低，药用趋向性不明显。因此，对疾病的疗效缺乏特异性作用； （7）酶的稳定性不高，对理化因素较为敏感，过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸 碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致 SOD 分子结构改变，酶活性丧失，形成不可逆性变化； （8）药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳。 针对 SOD 应用过程中客观存在的局限性，国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探 索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策。 4． SOD 的制备 SOD 广泛存在于动、植物和微生物体内，但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限 制，影响了 SOD 的生产成本和推广应用。 由于利用微生物（深红酵母）生产 SOD 具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限 制等优越性，因此，微生物 SOD 的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下： 菌体培养→破壁→菌体破片 → Rnase 酶解、离心 30 分钟 → 清液→ 上 DE32 柱 → 0.2mol/L NaCl 洗脱 → 洗脱液→ 加 45%（NH4）2SO4、离心 → 上清液 → 上 DE32 柱 → 洗脱 → 洗脱 液→ 浓缩→ 冷冻干燥→ SOD 成品。 破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的研究 表明，用甲苯法破壁对提取酵母 SOD 具有一定的优越性。另外，为了提高 SOD 纯度，在洗脱时可采用梯 度洗脱法。 5．SOD 的纯度检查 SOD 产品一般为浅绿色冻干粉，其纯度的检查主要根据以下三个指标。 （1）均一性 通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳，其操作简单，试剂单一且色带的 间隔比前者大，更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。 （2）酶的比活 要求达到一定的标准。如：化妆品用 SOD 比活≥3000u/mg 蛋白质；口服用 SOD 比活≥3500u/mg 蛋 白质；标准（活性测定用）及药用 SOD 比活≥5000u/mg 蛋白质；试剂用 SOD（电泳纯）比活≥8000u/mg 蛋白质。 （3）酶的重要理化性质 最重要的是金属离子含量（常采用原子吸收分光光度法测定）、氨基酸含量和吸收光谱。如 Cu·Zn –SOD 中 1 分子的酶必须含有相当于两原子 Cu 和两原子 Zn；虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍 然显示一定的规律；三种 SOD 都有特定的吸收光谱，观察纯酶的吸收光谱有助于判断 SOD 的纯度。 6．SOD 的（活性测定）分析方法 一般分为直接法和间接法两大类。 直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生 剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚 及近年发展起来的非酶体系的 NADH-PMS、核黄素-TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050；清除指示剂 则有最早发现的细胞色素 C、NBT，到近年来的鲁米诺和 MTT 等。 间接法中比色法最为常用，如黄嘌呤氧化酶-细胞色素 C 法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的 方法多年来不断得到改进，其灵敏度也不断得到提高。另外，近年来新建立了多种方法，如化学发光法、 光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高，受到人 们的青睐。 （1）黄嘌呤氧化酶（XO）- 细胞色素 C 法