第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展,英国人 Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为,自由基攻击生 命大分子造成组织细胞损伤,是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因,其中的 观点被越来越多的实验所证明 自由基( Free radical)是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物,具有高度的化学活性,是机 体有效的防御系统,若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除 它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器,造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各 种损伤,加速机体的衰老进程并诱发各种疾病 近年来,国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃,在各类食品科学、生命科学及医学书籍上 都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道,自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一,通过人 们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡,已受到食品营养学家的广泛重视 第一节自由基理论 、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基,它是由单质或化合物的均裂( Homdytic Fission)而产生的带有未成对电子的原子 或基团。它的单电子有强烈的配对倾向,倾向于以各种方式与其他原子基团结合,形成更稳定的结构,因 而自由基非常活泼,成为许多反应的活性中间体 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的95%。氧自 由基包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢分子(H2O2)、羟自由基(OH∽、氢过氧基(HO2-、烷过氧基 (ROO∽)、烷氧基(RO∽、氮氧自由基(NO-、过氧亚硝酸盐(ONOOˉ)、氢过氧化物(ROOH)和单 线态氧(O2)等,它们又统称为活性氧( reactive oxygen species,ROS),都是人体内最为重要的自由基 非氧自由基主要有氢自由基(H)和有机自由基(R)等。 (一)自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中,或者受到外界条件的刺激(如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、 杀虫剂、麻醉剂等药物,香烟烟雾和光化学空气污染物等作用),都会刺激机体产生活性氧自由基 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和 NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时,会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外,生物体内 的非酶氧化还原反应,如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界 环境,如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应,如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段,即引发、增长和终止阶段。反应之初,引发阶段占主导地位,反应体系中 的新生自由基形成许多链的开端,反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体,若起始有几个引发自 由基在扩展阶段没有消失或增加,那么反应中就有几条链。随着反应的进行,体系中的反应物浓度越来越
1 第五章 自由基清除剂 本章要点 1. 自由基理论的产生机理及来源 2. 自由基对机体活动的影响 3. 自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人 Harman 于 1956 年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生 命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的 观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机 体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除， 它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各 种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上 都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人 们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节 自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子 或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因 而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的 95%。氧自 由基包括超氧阴离子（O2 －·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2 －·）、烷过氧基 （ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单 线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。 非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、 杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和 NADPH 氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内 的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界 环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含 3 个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中 的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自 由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越
低,自由基相互碰头的机会越来越多,反应速度就越来越慢,自由基越来越少,最后反应停止。由此可见, 自由基反应动力学有别于普通的分子反应,自由基可以连续传递而出现连锁反应。 过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行,如果反应体系中有自由基清除剂存在,它就能很 快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机 物反应时产生自由基,而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应,阻止有机物的氧化,所以自由 基清除剂又称为抗氧化剂。 (二)自由基的来源 人体内特定的自由基有不同的来源 超氧阴离子自由基(O2-·)在其中扮演着非常重要的角色,因为在反应顺序上其他许多活性中间产物 的形成都始于与O2-·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、 NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧 产生的或由呼吸链裂解生成的。人体利用的氧气中约有1%~3%转化为O2- 过氧化氢分子(H2O2)也是一种重要的非自由基活性物,容易在活细胞中扩散。过氧化氢酶能有效地 将其转变成水,生成氧自由基 羟自由基(OH)的活性最强,其半衰期估计为109秒,其产生后能迅速起反应。在射线等高能辐射 下,通过体内水的均裂作用或经金属催化过程由内源的过氧化氢分子形成。紫外线能将过氧化氢分子分裂 成两个羟自由基分子 过氧基自由基的半衰期比较长,可达数秒,在生物系统中扩散的途径相当长。在脂质过氧化过程中 从多不饱和脂肪酸去掉一个氢原子开始,能形成过氧基自由基。羟自由基能启动这一反应过程 脂质过氧化作用进一步产生烷氧自由基(RO·和有机的氢过氧化物(ROOH),后者可能重排成为内 过氧化物中间产物,然后分裂产生乙醛。 单线态分子氧(O2)是另一种非自由基的活性物,可能是体内的组织暴露于光中形成的。其半衰期估 计为106秒,具体时间取决于周围基质的性质。它能通过转移其激发态能量或通过化学结合与其它分子相 互作用。单线态分子氧优先发生化学反应的靶为双键部位。 氧化氮自由基(NO)也是一种很重要的自由基,它是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物,能 松弛血小管平滑肌,防止血小板的凝集,从而降低血压。也可通过激活参与初级免疫的巨嗜细胞而产生 它的半衰期为6~50秒,很容易与氧发生反应,反应产物NO2也是自由基。它还能与生物分子直接反应或 与O2·结合形成过氧亚硝酸盐(ONOO)。NO·过多会产生细胞毒性。 、自由基对机体生命活动的影响 自由基是体内各种生化反应的中间代谢产物,在人体的生命活动过程中,各种生化反应,不管是酶促 反应还是非酶促反应,都会产生各种自由基。从自由基的化学结构可以看出,它含有未配对的电子,是 类具有高度化学活性的物质。在正常的情况下,体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中,并在代 谢中发挥着重要作用,参与一些酶和前列腺素的合成,增强白细胞吞噬活性,提高杀菌效果等。但是,如 果自由基过多或清除过慢,则会对人体造成严重危害 (一)自由基积极的生物学功能 自由基作为人体正常的代谢产物,对维持机体的正常代谢有特定的促进作用。这种促进作用主要表现 在对机体危害物的防御作用 1.增强白细胞的吞噬功能,提高杀菌效果 白细胞在吞噬细菌的过程中,对氧的消耗量激增,会产生大量的O2·和H2O2,两者通过 Haber- Weiss 反应还会进一步产生OH这些活性氧对病原菌都有很强的杀灭效果。OH·还可引发被吞噬细菌的不饱 和脂肪酸降解,降解终产物丙二醛也是一种强力杀菌剂,足以致细菌死亡。 2.促进前列腺素的合成 前列腺素是人体内的一种重要的激素,它以花生四烯酸为前驱物质,经膜上多酶系统催化氧化生成, 其生物合成途径中必须有氧自由基(OH·或O2·)的参与。 3.参与脂肪加氧酶的生成 血小板脂肪加氧酶作用于花生四烯酸生成1,2-氢过氧化-5,8,11,14-碳四烯酸(12- HPETE)及其
2 低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见， 自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。 过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很 快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机 物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由 基清除剂又称为抗氧化剂。 （二）自由基的来源 人体内特定的自由基有不同的来源。 超氧阴离子自由基（O2 －·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物 的形成都始于与 O2 －·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH 氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧 产生的或由呼吸链裂解生成的。人体利用的氧气中约有 1%～3%转化为 O2 －·。 过氧化氢分子（H2O2）也是一种重要的非自由基活性物，容易在活细胞中扩散。过氧化氢酶能有效地 将其转变成水，生成氧自由基。 羟自由基（OH·）的活性最强，其半衰期估计为 10-9 秒，其产生后能迅速起反应。在射线等高能辐射 下，通过体内水的均裂作用或经金属催化过程由内源的过氧化氢分子形成。紫外线能将过氧化氢分子分裂 成两个羟自由基分子。 过氧基自由基的半衰期比较长，可达数秒，在生物系统中扩散的途径相当长。在脂质过氧化过程中， 从多不饱和脂肪酸去掉一个氢原子开始，能形成过氧基自由基。羟自由基能启动这一反应过程。 脂质过氧化作用进一步产生烷氧自由基（RO·）和有机的氢过氧化物（ROOH），后者可能重排成为内 过氧化物中间产物，然后分裂产生乙醛。 单线态分子氧（1O2）是另一种非自由基的活性物，可能是体内的组织暴露于光中形成的。其半衰期估 计为 10-6 秒，具体时间取决于周围基质的性质。它能通过转移其激发态能量或通过化学结合与其它分子相 互作用。单线态分子氧优先发生化学反应的靶为双键部位。 氧化氮自由基（NO·）也是一种很重要的自由基，它是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，能 松弛血小管平滑肌，防止血小板的凝集，从而降低血压。也可通过激活参与初级免疫的巨嗜细胞而产生。 它的半衰期为 6～50 秒，很容易与氧发生反应，反应产物 NO2 也是自由基。它还能与生物分子直接反应或 与 O2 －·结合形成过氧亚硝酸盐（ONOO－）。NO·过多会产生细胞毒性。 二、自由基对机体生命活动的影响 自由基是体内各种生化反应的中间代谢产物，在人体的生命活动过程中，各种生化反应，不管是酶促 反应还是非酶促反应，都会产生各种自由基。从自由基的化学结构可以看出，它含有未配对的电子，是一 类具有高度化学活性的物质。在正常的情况下，体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，并在代 谢中发挥着重要作用，参与一些酶和前列腺素的合成，增强白细胞吞噬活性，提高杀菌效果等。但是，如 果自由基过多或清除过慢，则会对人体造成严重危害。 （一）自由基积极的生物学功能 自由基作为人体正常的代谢产物，对维持机体的正常代谢有特定的促进作用。这种促进作用主要表现 在对机体危害物的防御作用。 1．增强白细胞的吞噬功能，提高杀菌效果 白细胞在吞噬细菌的过程中，对氧的消耗量激增，会产生大量的 O2 －·和 H2O2 ，两者通过 Haber-Weiss 反应还会进一步产生 OH·，这些活性氧对病原菌都有很强的杀灭效果。OH·还可引发被吞噬细菌的不饱 和脂肪酸降解，降解终产物丙二醛也是一种强力杀菌剂，足以致细菌死亡。 2．促进前列腺素的合成 前列腺素是人体内的一种重要的激素，它以花生四烯酸为前驱物质，经膜上多酶系统催化氧化生成， 其生物合成途径中必须有氧自由基（OH·或 O2 －·）的参与。 3．参与脂肪加氧酶的生成 血小板脂肪加氧酶作用于花生四烯酸生成 1，2-氢过氧化-5，8，11，14-碳四烯酸（12-HPETE）及其
他相关的化合物,该类化合物是一系列具有强生物学活性化合物(如白三烯)的前体。在 HPETE形成过 程中有活性氧自由基参与。 4.参与胶原蛋白的合成 胶原蛋白的前体称原胶原蛋白。原胶原蛋白中的脯氨酸和赖氨酸经羟化酶的羟化作用是原胶原蛋白合 成的关键步骤。在此酶促羟化过程中,需要O2-·H2O2、OH·或lO2等活性氧自由基的参与。 5.参与肝脏的解毒作用 机体对外来毒物的解毒作用主要在肝脏进行,解毒作用实质是在肝微粒体细胞色素P450催化下对各 类毒物的羟化作用。一定剂量范围内的外来毒物可被羟化并排出体外而完成解毒作用,当剂量大时,机体 受不住就会出现中毒。在肝解毒过程中,连接于细胞色素上的O2-·自由基是真正起羟化作用的物质。 6.参加凝血酶原的合成 凝血酶原是凝血酶的前体。在凝血酶原合成过程中,其前体蛋白质氨基端的10个谷氨酸残基经过酶 促羧化作用转变为10个γ-羧基谷氨酸残基,形成凝血酶原。该羧化过程与氧自由基密切相关,没有氧自 由基的参加,就不能形成凝血酶原 7.参与血管壁松弛而降血压 NO·是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物,还作为细胞松弛因子而松弛血管壁,降低血压 血管扩张剂(如乙酰胆碱等)启动一个钙调节受体,在NO·合成酶催化和NAD参与下,氧化L-精氨酸 的胍基生成NO·并释放到细胞外。接着活化可溶性鸟苷酸环化酶,使血管平滑肌与血小板中的cGMP水平 增加,从而促进血管平滑肌松弛,抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上 8.杀伤外来微生物和肿瘤细胞 NO·和O2ˉ·结合以后生成ONOO阴离子,在略高于生理pH的碱性条件下相当稳定,从而允许其 由生成位置扩散转移到较远的位置。一旦在低于生理pH的酸性条件下(病理条件下往往如此),ONOOˉ 立即分解生成NO·和O2-·这两种自由基的氧化性非常强,具有很大的细胞毒性,对于杀伤外来微生物 和肿瘤细胞非常有意义。 然而,在生命活动中,由于经常受到各种外界不良因素的刺激,导致机体组织中的自由基数量往往过 多,甚至对机体组织产生危害 (二)自由基对生命大分子的损害 自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力,能通过氧化作用攻击体内的生命大分子,如核酸、 蛋白质、糖类和脂质等,使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂,从而引起细胞结构和功能的破坏,导 致机体的组织破坏和退行性变化。 OH·是最活泼的自由基,也是毒性最大的自由基。它可和活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤 而且反应速度极快,被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。 O2·的毒性是机体发生氧中毒的主要原因,由它引起的损伤表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱 和脂肪酸过氧化作用,进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用的改变及其他一系列的变化 所有能产生O2ˉ·的生物系统都能通过歧化反应生成H2O2,能使少数酶的SH(巯基)氧化失活。因 为H2O能迅速穿过细胞膜,而O2·不能,在细胞内的HO2能与Fe2+或Cu2+离子反应生成OH·另外 紫外线也能使H2O2均裂生成OH·这是H2O2毒性的真正原因 1.自由基对核酸的损害 自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化。例如,氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接链的 断裂、核糖的氧化和磷酸质键的断裂等。反应还会形成新的自由基,发生连锁反应,导致核酸碱基破坏, 产生遗传突变,严重受损的不能修复,导致细胞死亡 2.自由基对蛋白质的损害 自由基可直接作用于蛋白质,也可通过脂类过氧化产物间接作用于蛋白质而产生破坏作用。如过氧自 由基(ROO)可使蛋白质分子发生交联,生成变性的高聚物,其他自由基则可使蛋白质的多肽链断裂, 并使个别氨基酸发生化学变化。更严重的是,自由基可改变酶蛋白的化学结构,导致酶生物活性的丧失。 3.自由基对糖类的损害 自由基通过氧化性降解使多糖断裂,如影响脑脊液中的多糖,从而影响大脑的正常功能。自由基使核
3 他相关的化合物，该类化合物是一系列具有强生物学活性化合物（如白三烯）的前体。在 HPETE 形成过 程中有活性氧自由基参与。 4．参与胶原蛋白的合成 胶原蛋白的前体称原胶原蛋白。原胶原蛋白中的脯氨酸和赖氨酸经羟化酶的羟化作用是原胶原蛋白合 成的关键步骤。在此酶促羟化过程中，需要 O2 －·、H2O2 、OH·或 1O2 等活性氧自由基的参与。 5．参与肝脏的解毒作用 机体对外来毒物的解毒作用主要在肝脏进行，解毒作用实质是在肝微粒体细胞色素 P450 催化下对各 类毒物的羟化作用。一定剂量范围内的外来毒物可被羟化并排出体外而完成解毒作用，当剂量大时，机体 受不住就会出现中毒。在肝解毒过程中，连接于细胞色素上的 O2 －·自由基是真正起羟化作用的物质。 6．参加凝血酶原的合成 凝血酶原是凝血酶的前体。在凝血酶原合成过程中，其前体蛋白质氨基端的 10 个谷氨酸残基经过酶 促羧化作用转变为 10 个γ-羧基谷氨酸残基，形成凝血酶原。该羧化过程与氧自由基密切相关，没有氧自 由基的参加，就不能形成凝血酶原。 7．参与血管壁松弛而降血压 NO·是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，还作为细胞松弛因子而松弛血管壁，降低血压。 血管扩张剂（如乙酰胆碱等）启动一个钙调节受体，在 NO·合成酶催化和 NADPH 参与下，氧化 L-精氨酸 的胍基生成 NO·并释放到细胞外。接着活化可溶性鸟苷酸环化酶，使血管平滑肌与血小板中的 cGMP 水平 增加，从而促进血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上。 8．杀伤外来微生物和肿瘤细胞 NO·和 O2 －·结合以后生成 ONOO－阴离子，在略高于生理 pH 的碱性条件下相当稳定，从而允许其 由生成位置扩散转移到较远的位置。一旦在低于生理 pH 的酸性条件下（病理条件下往往如此），ONOO－ 立即分解生成 NO·和 O2 －·，这两种自由基的氧化性非常强，具有很大的细胞毒性，对于杀伤外来微生物 和肿瘤细胞非常有意义。 然而，在生命活动中，由于经常受到各种外界不良因素的刺激，导致机体组织中的自由基数量往往过 多，甚至对机体组织产生危害。 （二）自由基对生命大分子的损害 自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，能通过氧化作用攻击体内的生命大分子，如核酸、 蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导 致机体的组织破坏和退行性变化。 OH· 是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基。它可和活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤， 而且反应速度极快，被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。 O2 －·的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱 和脂肪酸过氧化作用，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用的改变及其他一系列的变化。 所有能产生 O2 －·的生物系统都能通过歧化反应生成 H2O2，能使少数酶的-SH（巯基）氧化失活。因 为 H2O2 能迅速穿过细胞膜，而 O2 －·不能，在细胞内的 H2O2 能与 Fe2+ 或 Cu2+ 离子反应生成 OH·，另外 紫外线也能使 H2O2 均裂生成 OH·，这是 H2O2 毒性的真正原因。 1．自由基对核酸的损害 自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化。例如，氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接链的 断裂、核糖的氧化和磷酸质键的断裂等。反应还会形成新的自由基，发生连锁反应，导致核酸碱基破坏， 产生遗传突变，严重受损的不能修复，导致细胞死亡。 2．自由基对蛋白质的损害 自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化产物间接作用于蛋白质而产生破坏作用。如过氧自 由基（ROO·）可使蛋白质分子发生交联，生成变性的高聚物，其他自由基则可使蛋白质的多肽链断裂， 并使个别氨基酸发生化学变化。更严重的是，自由基可改变酶蛋白的化学结构，导致酶生物活性的丧失。 3．自由基对糖类的损害 自由基通过氧化性降解使多糖断裂，如影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑的正常功能。自由基使核
糖、脱氧核糖形成脱氢自由基,导致DNA主链断裂或碱基破坏,还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化 生成不饱和的羰基或聚合成双聚物,从而破坏细胞膜上的多糖结构,影响细胞免疫功能的发挥。 4.自由基对脂质的损害 脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼,最易受自由基的破坏,发生过氧化反应。 磷脂是构成生物膜的重要部分,因富含多不饱和脂肪酸故极易受自由基破坏。膜中磷脂发生过氧化作用, 会引起膜中蛋白质及酶的交联或失活,导致膜通透性的变化,严重影响膜的各种生理功能。亚细胞器膜磷 脂所含的不饱和脂肪酸比质膜的还多,所以对过氧化反应更为敏感。如果细胞内线粒体膜被氧化受损,则 会使能量生成系统受到影响。溶酶体膜若受到破坏则会释放岀其中的水解酶系,会使细胞内多种物质水解 严重时甚至会造成细胞自溶,组织坏死。由此可见,若自由基对生物膜的破坏很严重,就会引起细胞功能 的极大紊乱。 (三)自由基学说 人们根据对衰老机理的不同理解,提出了许多种衰老学说,主要有自由基学说、免疫功能下降学说 脑中心学说、代谢失调学说、生物膜衰老学说、脂褐素与衰老学说、衰老过程中基因淋巴因子及其基因表 达改变的学说等。自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中的种种症状,如老年斑、皱纹及免疫力下 降等,是目前最有说服力的学说 自由基学说认为,自由基的强氧化作用,损伤了机体的生命大分子,引起人体细胞免疫和体液免疫的 功能减弱,最终导致免疫疾病的出现。其作用机理可概括为以下几个方面 1.生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积 自由基作用于脂质能发生过氧化反应,其氧化的终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的 交联聚合,形成脂褐素。由于脂褐素不溶于水,所以不能随着机体的代谢排出体外,在细胞内逐渐堆积。 其颗粒呈圆形或椭圆形,直径约为1-~5微米,颗粒大小会随年龄的增大而增大。老年斑就是由脂褐素在皮 肤的堆积而形成的,老年斑的出现是人体衰老的一个明显的外表象征。另外,随着胶原蛋白的交联聚合, 会使胶原蛋白溶解性下降、弹性降低及水合能力减弱,会导致皮肤失去张力,皱纹增多,老年骨质再生能 力减弱等。脂褐素在脑细胞中的堆积,会出现记忆力的减退或使智力发生障碍,甚至出现老年性痴呆症 眼球晶状体长期暴露于光和氧中,极易发生脂质氧化损伤,导致视网膜模糊,引起白内障和老年黄斑变性 2.器官组织细胞的破坏与减少 器官组织细胞的破坏与减少是机体衰老的症状之一。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基引起 的脂质过氧化而造成对细胞膜与细胞器膜的损害,改变了生物膜的结构与功能,影响了膜的通透性与流动 性,从而导致了膜功能的紊乱,加快机体的衰老 另外,自由基作用于核酸引起的基因突变改变了遗传信息的传递,导致蛋白质与酶的合成错误及酶活 性的降低。自由基还可与膜上的酶发生作用,影响细胞正常生理功能的发挥。自由基通过对脂质的侵袭加 速了细胞的衰老进程。这些结果的积累,造成了器官组织细胞的老化与死亡 3.兔疫功能的降低 免疫功能是指机体抵抗外来有害物质入侵的能力。人体内的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫。自由 基作用于免疫系统,会引起人体细胞免疫与体液免疫功能减弱,并使免疫识别力下降,免疫系统在攻击病 原体和异常的细胞时,也侵犯了自身正常的细胞和健康组织而出现自身免疫性疾病 有研究表明,弥散性硬皮病、系统性硬结、溃疡性结肠炎和成胶质病变等自身免疫性疾病往往伴有较 多的染色体断裂现象,这类病人血液中有一种血清因子能够促进正常的淋巴细胞染色体发生断裂。自身免 疫疾病的病变过程与自由基关系密切,其致病机理可能是由于特殊血清断裂因子的作用或细胞的氧化代谢 而产生了大量的OH·和O2-·所致 四)自由基与疾病的关系 越来越多的临床和干预实验,以及来自基础研究的证据表明,自由基参与许多疾病的病理过程,从而 诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。 1.自由基与心血管疾病 大多数心血管疾病的主要原因是动脉粥样硬化,是动脉壁的一种多因素疾病。自由基攻击动脉血管壁 和血清中的不饱和脂肪酸使之发生过氧化反应而生成过氧化脂质,后者能刺激动脉壁,增加粥样硬化的趋
4 糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致 DNA 主链断裂或碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化， 生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。 4．自由基对脂质的损害 脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基的破坏，发生过氧化反应。 磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和脂肪酸故极易受自由基破坏。膜中磷脂发生过氧化作用， 会引起膜中蛋白质及酶的交联或失活，导致膜通透性的变化，严重影响膜的各种生理功能。亚细胞器膜磷 脂所含的不饱和脂肪酸比质膜的还多，所以对过氧化反应更为敏感。如果细胞内线粒体膜被氧化受损，则 会使能量生成系统受到影响。溶酶体膜若受到破坏则会释放出其中的水解酶系，会使细胞内多种物质水解， 严重时甚至会造成细胞自溶，组织坏死。由此可见，若自由基对生物膜的破坏很严重，就会引起细胞功能 的极大紊乱。 （三）自由基学说 人们根据对衰老机理的不同理解，提出了许多种衰老学说，主要有自由基学说、免疫功能下降学说、 脑中心学说、代谢失调学说、生物膜衰老学说、脂褐素与衰老学说、衰老过程中基因淋巴因子及其基因表 达改变的学说等。自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中的种种症状，如老年斑、皱纹及免疫力下 降等，是目前最有说服力的学说。 自由基学说认为，自由基的强氧化作用，损伤了机体的生命大分子，引起人体细胞免疫和体液免疫的 功能减弱，最终导致免疫疾病的出现。其作用机理可概括为以下几个方面。 1．生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积 自由基作用于脂质能发生过氧化反应，其氧化的终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的 交联聚合，形成脂褐素。由于脂褐素不溶于水，所以不能随着机体的代谢排出体外，在细胞内逐渐堆积。 其颗粒呈圆形或椭圆形，直径约为 1~5 微米，颗粒大小会随年龄的增大而增大。老年斑就是由脂褐素在皮 肤的堆积而形成的，老年斑的出现是人体衰老的一个明显的外表象征。另外，随着胶原蛋白的交联聚合， 会使胶原蛋白溶解性下降、弹性降低及水合能力减弱，会导致皮肤失去张力，皱纹增多，老年骨质再生能 力减弱等。脂褐素在脑细胞中的堆积，会出现记忆力的减退或使智力发生障碍，甚至出现老年性痴呆症。 眼球晶状体长期暴露于光和氧中，极易发生脂质氧化损伤，导致视网膜模糊，引起白内障和老年黄斑变性。 2．器官组织细胞的破坏与减少 器官组织细胞的破坏与减少是机体衰老的症状之一。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基引起 的脂质过氧化而造成对细胞膜与细胞器膜的损害，改变了生物膜的结构与功能，影响了膜的通透性与流动 性，从而导致了膜功能的紊乱，加快机体的衰老。 另外，自由基作用于核酸引起的基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误及酶活 性的降低。自由基还可与膜上的酶发生作用，影响细胞正常生理功能的发挥。自由基通过对脂质的侵袭加 速了细胞的衰老进程。这些结果的积累，造成了器官组织细胞的老化与死亡。 3．免疫功能的降低 免疫功能是指机体抵抗外来有害物质入侵的能力。人体内的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫。自由 基作用于免疫系统，会引起人体细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降，免疫系统在攻击病 原体和异常的细胞时，也侵犯了自身正常的细胞和健康组织而出现自身免疫性疾病。 有研究表明，弥散性硬皮病、系统性硬结、溃疡性结肠炎和成胶质病变等自身免疫性疾病往往伴有较 多的染色体断裂现象，这类病人血液中有一种血清因子能够促进正常的淋巴细胞染色体发生断裂。自身免 疫疾病的病变过程与自由基关系密切，其致病机理可能是由于特殊血清断裂因子的作用或细胞的氧化代谢 而产生了大量的 OH·和 O2 －·所致。 （四）自由基与疾病的关系 越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，从而 诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。 1．自由基与心血管疾病 大多数心血管疾病的主要原因是动脉粥样硬化，是动脉壁的一种多因素疾病。自由基攻击动脉血管壁 和血清中的不饱和脂肪酸使之发生过氧化反应而生成过氧化脂质，后者能刺激动脉壁，增加粥样硬化的趋
势。动脉硬化的程度与硬化斑中脂质过氧化程度呈正相关,血管内壁的蜡样物质就是脂质发生过氧化反应 的直接证明。动脉粥样硬化的早期,在内皮下层间隙形成脂质沉淀,即所谓的脂肪条纹。随着年龄的增加 粥样硬化症呈增多的趋势,这与老年人动脉壁不饱和脂肪酸含量高,血清中Fe2+和Cu2+含量高,Fe2或Cu2 通过 Haber- Weiss反应促使OH·产生,OH·的存在加剧了脂质过氧化进程。过氧化产物丙二醛促使弹性 蛋白发生交联,破坏了其正常的结构和功能,其应有的弹性与水结合能力丧失,最终产生了动脉硬化症, 从而引起冠心病等其他心血管疾病。 2.自由基与癌症 致癌过程是一个复杂的多阶段的过程,包括诱发和促进两步。一个正常的细胞发生癌变必须经历诱发 和促进这两个阶段,这就是两步致癌学说 大量研究证明,诱发阶段与自由基关系密切,促癌阶段也与自由基有关,促癌能力与其产生自由基的 能力相平行。致癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻击DNA才能致癌,抗癌剂也必须通过自由 基形式去杀死癌症 3.自由基与肺气肿 自由基作用于肺部的巨嗜细胞,使其释放了蛋白水解酶类而导致了对肺组织的损伤破坏,从而引起细 支气管和肺泡管的破裂,肺泡间隔面积缩小,周围血液与肺之间气体交换量减少,导致肺气肿 正常情况下,肺组织细胞间的蛋白酶与抗蛋白酶能够保持平衡,蛋白酶抑制剂控制着水解蛋白酶类的 释放与活性。如果缺乏这种抑制剂,就有可能导致肺气肿。长期吸λ香烟及其他大气中的污染物,会使肺 中氧自由基增多,使水解蛋白酶增多和使水解蛋白酶的天然抑制剂失活,最终导致肺气肿的出现 4.自由基与缺血后重灌流损伤 缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。有许多证据说明,在完全性缺血、缺氧时,组织损 伤程度较轻,而在缺血后再灌注时,由于自由基的急剧増多而使组织损伤更加严重 在缺血后重灌流状态下,细胞内的氧自由基主要来自黄嘌呤氧化酶,它是由前体黄嘌呤脱氢酶转变而 来的。该脱氢酶广泛存在于各种组织细胞中,它是以NAD为电子接受体,所以不产生自由基。当组织细 胞缺血时,ATP生成量减少,导致细胞内能量不足,不能维持正常的离子浓度。于是,Ca重新分布使得 细胞内Ca浓度增大,激活了一种蛋白酶而将脱氢酶不可逆地转化成氧化酶。另外,缺血使得细胞内AIP 减少,AMP增多,AMP又可逐步分解成次黄嘌呤,而次黄嘌呤是氧化酶的适宜作用底物。当重灌流时 氧分子重新进入组织,与组织中积累的次黄嘌呤和氧化酶发生反应,生成大量的活性氧自由基。这些活泼 且有强氧化性的自由基使细胞膜脂质过氧化,使透明质酸和胶原蛋白降解,从而改变了细胞的结构与功能, 造成组织的不可逆损伤。另外,在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍,从而加剧 了自由基对缺血后重灌流组织的损伤。 5.自由基与眼病 由自由基氧化损伤引起的视力损害,最常见的当数白内障和老年黄斑变性。 老年人由于全身机体的衰老使得眼球晶状体中自由基清除剂的含量与活性降低,导致对自由基侵害的 抵御能力降低。许多事实表明,白内障的起因和发展与自由基对视网膜的损伤导致晶状体组织的破坏有关。 又由于眼晶状体长期暴露于光和氧中,所形成的活性氧类物质可能与晶体蛋白质起反应。受损的蛋白 质可能聚合和沉淀,从而丧失原来的功能。视觉活性最高的视网膜组织易受损害,从而引起老年黄斑变性 6.自由基与炎症 当局部氧量过少或外来病原菌侵袭时,大量多形嗜中性白细胞积聚在病变处。这些白细胞由特殊作用 的代谢物激活,结合在膜上的 NADPH2氧化酶被激活,氧化 NADPH2成为NADP+,同时产生大量的O2 氧自由基一方面破坏病原菌和病变细胞,另一方面进攻白细胞本身而造成白细胞大量死亡,引起溶酶体酶 ]大量释放,进而杀伤组织细胞,造成骨、软骨的破坏,导致炎症和关节炎 7.自由基与贫血 贫血的出现也与自由基有关。据研究表明,地中海贫血的病理变化包含红细胞膜的过氧化,膜上多不 饱和脂肪酸含量减少,-SH转变成SS基团和维生素E含量减少。缺铁性贫血的病变过程也有自由基参与, 因为此时红细胞的维生素E和过氧化酶含量减少,易被自由基破坏而缩短寿命。 8.自由基与癜痫
5 势。动脉硬化的程度与硬化斑中脂质过氧化程度呈正相关，血管内壁的蜡样物质就是脂质发生过氧化反应 的直接证明。动脉粥样硬化的早期，在内皮下层间隙形成脂质沉淀，即所谓的脂肪条纹。随着年龄的增加， 粥样硬化症呈增多的趋势，这与老年人动脉壁不饱和脂肪酸含量高，血清中 Fe2+和 Cu2+含量高，Fe2+或 Cu2+ 通过 Haber-Weiss 反应促使 OH·产生，OH·的存在加剧了脂质过氧化进程。过氧化产物丙二醛促使弹性 蛋白发生交联，破坏了其正常的结构和功能，其应有的弹性与水结合能力丧失，最终产生了动脉硬化症， 从而引起冠心病等其他心血管疾病。 2．自由基与癌症 致癌过程是一个复杂的多阶段的过程，包括诱发和促进两步。一个正常的细胞发生癌变必须经历诱发 和促进这两个阶段，这就是两步致癌学说。 大量研究证明，诱发阶段与自由基关系密切，促癌阶段也与自由基有关，促癌能力与其产生自由基的 能力相平行。致癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻击 DNA 才能致癌，抗癌剂也必须通过自由 基形式去杀死癌症。 3．自由基与肺气肿 自由基作用于肺部的巨嗜细胞，使其释放了蛋白水解酶类而导致了对肺组织的损伤破坏，从而引起细 支气管和肺泡管的破裂，肺泡间隔面积缩小，周围血液与肺之间气体交换量减少，导致肺气肿。 正常情况下，肺组织细胞间的蛋白酶与抗蛋白酶能够保持平衡，蛋白酶抑制剂控制着水解蛋白酶类的 释放与活性。如果缺乏这种抑制剂，就有可能导致肺气肿。长期吸入香烟及其他大气中的污染物，会使肺 中氧自由基增多，使水解蛋白酶增多和使水解蛋白酶的天然抑制剂失活，最终导致肺气肿的出现。 4．自由基与缺血后重灌流损伤 缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。有许多证据说明，在完全性缺血、缺氧时，组织损 伤程度较轻，而在缺血后再灌注时，由于自由基的急剧增多而使组织损伤更加严重。 在缺血后重灌流状态下，细胞内的氧自由基主要来自黄嘌呤氧化酶，它是由前体黄嘌呤脱氢酶转变而 来的。该脱氢酶广泛存在于各种组织细胞中，它是以 NAD+为电子接受体，所以不产生自由基。当组织细 胞缺血时，ATP 生成量减少，导致细胞内能量不足，不能维持正常的离子浓度。于是，Ca++重新分布使得 细胞内 Ca++浓度增大，激活了一种蛋白酶而将脱氢酶不可逆地转化成氧化酶。另外，缺血使得细胞内 ATP 减少，AMP 增多，AMP 又可逐步分解成次黄嘌呤，而次黄嘌呤是氧化酶的适宜作用底物。当重灌流时， 氧分子重新进入组织，与组织中积累的次黄嘌呤和氧化酶发生反应，生成大量的活性氧自由基。这些活泼 且有强氧化性的自由基使细胞膜脂质过氧化，使透明质酸和胶原蛋白降解，从而改变了细胞的结构与功能， 造成组织的不可逆损伤。另外，在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧 了自由基对缺血后重灌流组织的损伤。 5．自由基与眼病 由自由基氧化损伤引起的视力损害，最常见的当数白内障和老年黄斑变性。 老年人由于全身机体的衰老使得眼球晶状体中自由基清除剂的含量与活性降低，导致对自由基侵害的 抵御能力降低。许多事实表明，白内障的起因和发展与自由基对视网膜的损伤导致晶状体组织的破坏有关。 又由于眼晶状体长期暴露于光和氧中，所形成的活性氧类物质可能与晶体蛋白质起反应。受损的蛋白 质可能聚合和沉淀，从而丧失原来的功能。视觉活性最高的视网膜组织易受损害，从而引起老年黄斑变性。 6．自由基与炎症 当局部氧量过少或外来病原菌侵袭时，大量多形嗜中性白细胞积聚在病变处。这些白细胞由特殊作用 的代谢物激活，结合在膜上的 NADPH2 氧化酶被激活，氧化 NADPH2 成为 NADP+，同时产生大量的 O2 －·。 氧自由基一方面破坏病原菌和病变细胞，另一方面进攻白细胞本身而造成白细胞大量死亡，引起溶酶体酶 的大量释放，进而杀伤组织细胞，造成骨、软骨的破坏，导致炎症和关节炎。 7．自由基与贫血 贫血的出现也与自由基有关。据研究表明，地中海贫血的病理变化包含红细胞膜的过氧化，膜上多不 饱和脂肪酸含量减少，-SH 转变成-S-S 基团和维生素 E 含量减少。缺铁性贫血的病变过程也有自由基参与， 因为此时红细胞的维生素 E 和过氧化酶含量减少，易被自由基破坏而缩短寿命。 8．自由基与癫痫
有关研究证明,癫痫活动伴有活跃的自由基反应。清除自由基,阻断自由基反应对癫痫的预防和治疗 有一定作用。自由基反应在癫痫发生中的作用日益受到重视。 目前认为,老年性聋与自由基受损关系密切;自由基与糖尿病也有比较复杂的关系:大骨节病与克山 病也有密切的关系。随着自由基理论的研究发展,许多人类重大疾病与自由基反应的关系正在逐步被揭示。 自由基对人类健康的影响作用正在被更多的人所接受,越来越多的专家正在运用自由基理论,在确保人体 健康方面的研究中取得较大的成果。 第二节自由基清除剂 、自由基清除剂简介 自由基是人体正常的代谢产物,正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中,人体 内存在少量的氧自由基,不但对人体不构成威胁,而且可以促进细胞增殖,刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细 菌,消除炎症,分解毒物。但如果人体内自由基的数量过多,就会对生物膜和其他组织造成损伤,破坏细 胞结构,干扰人体的正常代谢活动,引起疾病,加速人体衰老进程。 在长期的进化过程中,生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基,将它们统称为自由基清 除剂( Scavenger)。 自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。自由基淸除剂的种类繁多, 可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶,主要有超氧化物歧化酶(SOD) 过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等几种。非酶类自由基清除剂一般包括黄酮类、多糖类 维生素C、维生素E、β-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽(GSH)等活性肽类。 自由基清除剂大多为抗氧化剂,通过清除作用降低活泼自由基中间体浓度,降低自由基连锁反应中扩 展阶段的效率来控制自由基的生成。但有些抗氧化剂是通过抑制自由基引发剂(如某些金属元素)的产生 而起作用的。自由基清除剂也不都是抗氧化剂,有些系统并未进行氧化作用 自由基清除剂发挥作用必须满足三个条件:第一,自由基清除剂要有一定的浓度;第二,因为自由基 活泼性极强,一旦产生马上就会与附近的生命大分子起作用,所以自由基清除剂必须在自由基附近,并且 能以极快的速度抢先与自由基结合,否则就起不到应有的效果;第三,在大多数情况下,清除剂与自由基 反应后会变成新的自由基,这个新的自由基的毒性应小于原来自由基的毒性才有防御作用。 这些自由基清除剂对维持机体的正常生命活动,保持健康起着重要的作用。但是,随着年龄的增长 机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降,从而减弱了对自由基损害的防御能力,使机体组织器官容易受 损,加速了机体的衰老,引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生,可以人为地由膳食补充自由基清 除剂,从而达到防御疾病、延缓衰老的目的 、酶类自由基清除剂 (一)超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD) 超氧化物歧化酶(SOD)是目前研究得最深入、应用得最广泛的一种酶类自由基清除剂。 1.种类、结构及分布 1968年,美国人 McCord在 Fridovich指导下,从牛红细胞中提取Cu·Zn的酶蛋白质,并发现它能 催化O2ˉ·歧化,所以把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶,英文简称为SOD。 SOD存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内,包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中。SOD 是一类含金属的酶,按其所含金属辅基不同可分为含铜锌SOD(Cu·Zn-SOD)、含锰SOD(Mn-SOD)和 含铁SOD( Fe-SOD)3种 含铜锌金属辅基的Cu·Zn-SOD是最为常见的一种酶,主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的 叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。在动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织 中均有存在,是目前应用最广泛的一类酶。该酶由两条肽链组成,每条肽链含有铜、锌原子各一个,活性 中心的核心是铜
6 有关研究证明，癫痫活动伴有活跃的自由基反应。清除自由基，阻断自由基反应对癫痫的预防和治疗 有一定作用。自由基反应在癫痫发生中的作用日益受到重视。 目前认为，老年性聋与自由基受损关系密切；自由基与糖尿病也有比较复杂的关系；大骨节病与克山 病也有密切的关系。随着自由基理论的研究发展，许多人类重大疾病与自由基反应的关系正在逐步被揭示。 自由基对人类健康的影响作用正在被更多的人所接受，越来越多的专家正在运用自由基理论，在确保人体 健康方面的研究中取得较大的成果。 第二节 自由基清除剂 一、自由基清除剂简介 自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中，人体 内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细 菌，消除炎症，分解毒物。但如果人体内自由基的数量过多，就会对生物膜和其他组织造成损伤，破坏细 胞结构，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加速人体衰老进程。 在长期的进化过程中，生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基，将它们统称为自由基清 除剂（Scavenger）。 自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。自由基清除剂的种类繁多， 可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶， 主要有超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等几种。非酶类自由基清除剂一般包括黄酮类、多糖类、 维生素 C 、维生素 E、β-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽（GSH）等活性肽类。 自由基清除剂大多为抗氧化剂，通过清除作用降低活泼自由基中间体浓度，降低自由基连锁反应中扩 展阶段的效率来控制自由基的生成。但有些抗氧化剂是通过抑制自由基引发剂（如某些金属元素）的产生 而起作用的。自由基清除剂也不都是抗氧化剂，有些系统并未进行氧化作用。 自由基清除剂发挥作用必须满足三个条件：第一，自由基清除剂要有一定的浓度；第二，因为自由基 活泼性极强，一旦产生马上就会与附近的生命大分子起作用，所以自由基清除剂必须在自由基附近，并且 能以极快的速度抢先与自由基结合，否则就起不到应有的效果；第三，在大多数情况下，清除剂与自由基 反应后会变成新的自由基，这个新的自由基的毒性应小于原来自由基的毒性才有防御作用。 这些自由基清除剂对维持机体的正常生命活动，保持健康起着重要的作用。但是，随着年龄的增长， 机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受 损，加速了机体的衰老，引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生，可以人为地由膳食补充自由基清 除剂，从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。 二、酶类自由基清除剂 （一）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 超氧化物歧化酶（SOD）是目前研究得最深入、应用得最广泛的一种酶类自由基清除剂。 1．种类、结构及分布 1968 年，美国人 McCord 在 Fridovich 指导下，从牛红细胞中提取 Cu·Zn 的酶蛋白质，并发现它能 催化 O2 －·歧化，所以把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶，英文简称为 SOD。 SOD 存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中。SOD 是一类含金属的酶，按其所含金属辅基不同可分为含铜锌 SOD（Cu·Zn-SOD）、含锰 SOD（Mn-SOD）和 含铁 SOD（Fe-SOD）3 种。 含铜锌金属辅基的 Cu·Zn-SOD 是最为常见的一种酶，主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的 叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。在动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织 中均有存在，是目前应用最广泛的一类酶。该酶由两条肽链组成，每条肽链含有铜、锌原子各一个，活性 中心的核心是铜
Fe-SOD主要存在于原核细胞中,一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在 此酶也由两条肽链组成,一般每个二聚体含有一个铁原子。 Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中,在植物的叶绿体基质、类囊体内也会存在,在 人体肝脏中含量较高。此酶的纯品呈粉红色,由两条或四条肽链组成。 2.理化及生物学特性 SOD属酸性蛋白酶,对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。又由于SOD属于金属酶,其性质 不仅取决于蛋白质,还取决于结合到活性部位的金属离子。三类SOD的活性中心都含有金属离子。如采 用物理或化学方法除去金属离子,则酶活丧失;如重新加上金属离子,则酶活又恢复, 不同来源的(u·Zn-SOD具有较高的同源性,它们的物化特性也很相似,据推测它们可能由同一原始 酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性,它们可能由另一原 始酶进化而成 SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶,对氧自由基有强烈清除作用,特别对于超氧 阴离子(O2-),SOD可将其催化歧化而生成H2O2和O2,故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异 3.SOD的生理功能及应用 SOD作为功能性食品基料的生理功能主要有以下几方面 (1)清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基,保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2·的破坏作用, 减轻或延缓甚至治愈某些疾病,延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象,如延缓皮肤衰老和老年 斑的形成等 (2)提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力,增强机体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适 应性 (3)增强人体自身的免疫力,提高人体对自由基受损引发的一系列疾病的抵抗力,如炎症、肿瘤、 白内障、肺气肿等,治疗由于免疫功能下降而引发的疾病; (4)清除放疗所诱发的大量自由基,从而减少放射对人体其他正常组织的损伤,减轻癌症等肿瘤患 者放化疗时的痛苦及副作用 (5)消除疲劳,增强对剧烈运动的适应力。 因此,具有清除自由基功能的SOD就成为医学、食品和生命科学等领域研究的热点。 目前,SOD已广泛地应用于人们生活的各个方面。如深受女性消费者喜爱的化妆品中有大宝SOD 康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD添加于化妆品有明显的防晒效果和抗炎作用,可有效防止皮肤受 电离辐射(如紫外线)的损伤。 SOD在医疗上的应用更是不胜枚举,它尤其对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外,SOD 对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。 SOD在食品方面的应用也极为广泛,可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂,有良好的抗衰 老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国外把SOD作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国 内也开发出了多种强化SOD的食品,如SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD果汁饮料、SOD的酸奶 和SOD口服液等。还可用富含SOD的原料加工制成功能性食品,如大蒜饮料、刺梨SOD汁等。在人们 越来越注重健康饮食的今天,SOD将成为功能食品中的活跃分子。 然而,SOD作为一类高分子抗氧化酶,分子量在32000道尔顿以上,又都带有金属辅基,且其来源大 多从动物血(猪血、牛血)和动物脏器以及某些微生物中制备而来,多为生物种属差异很大的异源性蛋白 因此,在应用上,它除了具有严格的针对性和有效性外,必然也有很大的局限性。SOD应用的局限性归纳 起来主要有8个方面 (1)半衰期短。SOD的体内半衰期为6~8分钟,体外半衰期(25℃时)为9~10天。因此,体内注 射表现为多次数、少浓度,体外涂抹则表现为高剂量、低效应 (2)代谢速率快。SOD在体内代谢速率极快,注射6小时后,90%以上的大分子SOD经降解为小分 子而随泌尿系统排泄 (3)酶分子量大,均在32000以上。其中,原核细胞Mn-SOD分子量为40000真核细胞线粒体 Mn-SOD
7 Fe-SOD 主要存在于原核细胞中，一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在。 此酶也由两条肽链组成，一般每个二聚体含有一个铁原子。 Mn-SOD 主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，在植物的叶绿体基质、类囊体内也会存在，在 人体肝脏中含量较高。此酶的纯品呈粉红色，由两条或四条肽链组成。 2．理化及生物学特性 SOD 属酸性蛋白酶，对 pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。又由于 SOD 属于金属酶，其性质 不仅取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。三类 SOD 的活性中心都含有金属离子。如采 用物理或化学方法除去金属离子，则酶活丧失；如重新加上金属离子，则酶活又恢复。 不同来源的 Cu·Zn-SOD 具有较高的同源性，它们的物化特性也很相似，据推测它们可能由同一原始 酶进化而来。不同来源的 Mn-SOD 和 Fe-SOD 也具有相似的物理性质和较高的同源性，它们可能由另一原 始酶进化而成。 SOD 是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧 阴离子（O2 －·）， SOD 可将其催化歧化而生成 H2O2 和 O2，故 SOD 又称为清除超氧阴离子自由基的特异 酶。 3．SOD 的生理功能及应用 SOD 作为功能性食品基料的生理功能主要有以下几方面。 （1）清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基，保护 DNA、蛋白质和细胞膜免遭 O2 －·的破坏作用， 减轻或延缓甚至治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象，如延缓皮肤衰老和老年 斑的形成等； （2）提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，增强机体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适 应性； （3）增强人体自身的免疫力，提高人体对自由基受损引发的一系列疾病的抵抗力，如炎症、肿瘤、 白内障、肺气肿等，治疗由于免疫功能下降而引发的疾病； （4）清除放疗所诱发的大量自由基，从而减少放射对人体其他正常组织的损伤，减轻癌症等肿瘤患 者放化疗时的痛苦及副作用； （5）消除疲劳，增强对剧烈运动的适应力。 因此，具有清除自由基功能的 SOD 就成为医学、食品和生命科学等领域研究的热点。 目前，SOD 已广泛地应用于人们生活的各个方面。如深受女性消费者喜爱的化妆品中有大宝 SOD、 康妮 SOD 、SOD 康舒达霜剂等。SOD 添加于化妆品有明显的防晒效果和抗炎作用，可有效防止皮肤受 电离辐射（如紫外线）的损伤。 SOD 在医疗上的应用更是不胜枚举，它尤其对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外，SOD 对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。 SOD 在食品方面的应用也极为广泛，可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂，有良好的抗衰 老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国外把 SOD 作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国 内也开发出了多种强化 SOD 的食品，如 SOD 雪糕、SOD 豆奶、SOD 啤酒、SOD 果汁饮料、SOD 的酸奶 和 SOD 口服液等。还可用富含 SOD 的原料加工制成功能性食品，如大蒜饮料、刺梨 SOD 汁等。在人们 越来越注重健康饮食的今天，SOD 将成为功能食品中的活跃分子。 然而，SOD 作为一类高分子抗氧化酶，分子量在 32000 道尔顿以上，又都带有金属辅基，且其来源大 多从动物血（猪血、牛血）和动物脏器以及某些微生物中制备而来，多为生物种属差异很大的异源性蛋白。 因此，在应用上，它除了具有严格的针对性和有效性外，必然也有很大的局限性。SOD 应用的局限性归纳 起来主要有 8 个方面： （1）半衰期短。SOD 的体内半衰期为 6～8 分钟，体外半衰期（25℃时）为 9～10 天。因此，体内注 射表现为多次数、少浓度，体外涂抹则表现为高剂量、低效应； （2）代谢速率快。SOD 在体内代谢速率极快，注射 6 小时后，90%以上的大分子 SOD 经降解为小分 子而随泌尿系统排泄； （3）酶分子量大，均在 32000 以上。其中，原核细胞 Mn-SOD 分子量为 40000；真核细胞线粒体 Mn-SOD
都由9个相等亚基组成,其分子量为80000。因此,透皮或透膜吸收困难,体内或细胞内作用弱 (4)酶制剂不宜口服,口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏,且SOD分子原形不易透 过肠粘膜,因而难以发挥全身性药效作用 (5)大分子异性蛋白,不宜大剂量、长时间使用,否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应,呈 现明显的不良反应性变化 (6)对靶细胞或靶部位的亲和力低,药用趋向性不明显。因此,对疾病的疗效缺乏特异性作用 (7)酶的稳定性不高,对理化因素较为敏感,过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸 碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致SOD分子结构改变,酶活性丧失,形成不可逆性变化 (8)药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳 针对SOD应用过程中客观存在的局限性,国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作,并已逐步探 索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策 4.SOD的制备 SOD广泛存在于动、植物和微生物体内,但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限 制,影响了SOD的生产成本和推广应用 由于利用微生物(深红酵母)生产SOD具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限 制等优越性,因此,微生物SOD的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下 菌体培养→破壁→菌体破片→Rnasε酶解、离心30分钟 清液→上DE32柱→02mol/L NaCl洗脱 洗脱液→加45%(NH4)2SO4、离心→上清液亠上DE32柱→洗脱→洗脱 液→浓缩→冷冻干燥→SOD成品。 破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的硏究 表明,用甲苯法破壁对提取酵母SOD具有一定的优越性。另外,为了提高SOD纯度,在洗脱时可采用梯 度洗脱法 5.SOD的纯度检查 SOD产品一般为浅绿色冻干粉,其纯度的检查主要根据以下三个指标 (1)均一性 通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检査其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳,其操作简单,试剂单一且色带的 间隔比前者大,更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。 (2)酶的比活 要求达到一定的标准。如:化妆品用SOD比活≥3000mg蛋白质;口服用SOD比活≥3500umg蛋 白质;标准(活性测定用)及药用SOD比活≥5000mg蛋白质;试剂用SOD(电泳纯)比活≥800mng 蛋白质 (3)酶的重要理化性质 最重要的是金属离子含量(常采用原子吸收分光光度法测定)氨基酸含量和吸收光谱。如Cun-SOD 中1分子的酶必须含有相当于两原子Cu和两原子Zn;虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致,但仍 然显示一定的规律;三种SOD都有特定的吸收光谱,观察纯酶的吸收光谱有助于判断SOD的纯度。 6.SOD的(活性测定)分析方法 一般分为直接法和间接法两大类 直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器,在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生 剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚 及近年发展起来的非酶体系的NADH-PMS、核黄素- TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050:清除指示剂 则有最早发现的细胞色素C、NBT,到近年来的鲁米诺和MIT等 间接法中比色法最为常用,如黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的 方法多年来不断得到改进,其灵敏度也不断得到提高。另外,近年来新建立了多种方法,如化学发光法、 光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高,受到人 们的青睐。 (1)黄嘌呤氧化酶(XO)-细胞色素C法
8 都由 9 个相等亚基组成，其分子量为 80000。因此，透皮或透膜吸收困难，体内或细胞内作用弱； （4）酶制剂不宜口服，口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏，且 SOD 分子原形不易透 过肠粘膜，因而难以发挥全身性药效作用； （5）大分子异性蛋白，不宜大剂量、长时间使用，否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应，呈 现明显的不良反应性变化； （6）对靶细胞或靶部位的亲和力低，药用趋向性不明显。因此，对疾病的疗效缺乏特异性作用； （7）酶的稳定性不高，对理化因素较为敏感，过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸 碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致 SOD 分子结构改变，酶活性丧失，形成不可逆性变化； （8）药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳。 针对 SOD 应用过程中客观存在的局限性，国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探 索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策。 4． SOD 的制备 SOD 广泛存在于动、植物和微生物体内，但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限 制，影响了 SOD 的生产成本和推广应用。 由于利用微生物（深红酵母）生产 SOD 具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限 制等优越性，因此，微生物 SOD 的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下： 菌体培养→破壁→菌体破片 → Rnase 酶解、离心 30 分钟 → 清液→ 上 DE32 柱 → 0.2mol/L NaCl 洗脱 → 洗脱液→ 加 45%（NH4）2SO4、离心 → 上清液 → 上 DE32 柱 → 洗脱 → 洗脱 液→ 浓缩→ 冷冻干燥→ SOD 成品。 破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的研究 表明，用甲苯法破壁对提取酵母 SOD 具有一定的优越性。另外，为了提高 SOD 纯度，在洗脱时可采用梯 度洗脱法。 5．SOD 的纯度检查 SOD 产品一般为浅绿色冻干粉，其纯度的检查主要根据以下三个指标。 （1）均一性 通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳，其操作简单，试剂单一且色带的 间隔比前者大，更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。 （2）酶的比活 要求达到一定的标准。如：化妆品用 SOD 比活≥3000u/mg 蛋白质；口服用 SOD 比活≥3500u/mg 蛋 白质；标准（活性测定用）及药用 SOD 比活≥5000u/mg 蛋白质；试剂用 SOD（电泳纯）比活≥8000u/mg 蛋白质。 （3）酶的重要理化性质 最重要的是金属离子含量（常采用原子吸收分光光度法测定）、氨基酸含量和吸收光谱。如 Cu·Zn –SOD 中 1 分子的酶必须含有相当于两原子 Cu 和两原子 Zn；虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍 然显示一定的规律；三种 SOD 都有特定的吸收光谱，观察纯酶的吸收光谱有助于判断 SOD 的纯度。 6．SOD 的（活性测定）分析方法 一般分为直接法和间接法两大类。 直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生 剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚 及近年发展起来的非酶体系的 NADH-PMS、核黄素-TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050；清除指示剂 则有最早发现的细胞色素 C、NBT，到近年来的鲁米诺和 MTT 等。 间接法中比色法最为常用，如黄嘌呤氧化酶-细胞色素 C 法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的 方法多年来不断得到改进，其灵敏度也不断得到提高。另外，近年来新建立了多种方法，如化学发光法、 光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高，受到人 们的青睐。 （1）黄嘌呤氧化酶（XO）- 细胞色素 C 法
国外多以该法测定SOD活性。在SOD被发现之初就是利用此法进行测定的,又称之为 Mccord法, 被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为:在一定条件下,3ml反应液中,每分钟抑制氧化型细 胞色素C还原率达50%的酶量定为一个活力单位 McCord法灵敏度较低,但采取以下措施可得到提高 ①用乙酰化细胞色素C替代细胞色素C,可将灵敏度提高一倍,而且使测定结果不受样品中细胞色素 C氧化酶的影响 ②将pH7.8,o.05mol/磷酸缓冲液换成pH102的碳酸缓冲液,并将黄嘌呤浓度从0.05 mmol/L增至 0.10mmol/L,灵敏度可提高10倍 ③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10分钟,使O2ˉ·产量达到稳定程度,即O2ˉ· 生率与其自动歧化率达到平衡,灵敏度增加可高达710倍 ④利用FP9平行分析仪可进行半自动分析,快速、简便,可以同时测定多个样品。 (2)邻苯三酚自氧化法 国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法(简称 Marklund法), Marklund法是采用420nm处光吸收测定。 酶活力定义为:在一定条件下1m的反应液中,每分钟控制邻苯三酚在420nm波长的自氧化速率达50% 的酶量定为一个活力单位。 该方法经过不断改进,操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由420nm改用325nm,测试灵敏度 提高了64倍,称为微量邻苯三酚自氧化法,同时将邻苯三酚耗量减少一半; Marklund法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行,因此样品池必须保持恒温,且不 能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇(DIT)或L-抗坏血酸(VC)作为终止剂,使反应暂时停止, 使A420在一定时间内保持恒定,可同时测多个样品,有较高的重复性和回收率。同时,终止剂既不参与, 也不影响邻苯三酚的呈色反应,自氧化曲线与经典法的相吻合,最大抑制百分比和灵敏度也基本一致 另外,为消除HCl对SOD的抑制作用,改用K2HPO4-KH2PO4缓冲液替代Tris-H1缓冲液,灵敏度 可提高50 (3)化学发光法 化学发光法依据的原理是:O2·可与化学发光剂鲁米诺( luminol)反应,产生激发态产物,当其迅 速返回基态时,即发出光。SOD可消除O2-·从而使发光强度降低,SOD浓度与发光百分率在一定时间 内呈线性关系。活力单位定义为:在一定条件下,使每毫升反应液于1分钟末发光率被抑制50%的酶量作 为一个酶活力 同传统的比色法相比较,化学发光法专一性较强,其他干扰因素少,灵敏度高,最适用作粗提取液中 SOD活性的检测。 (4)极谱氧电极法 比色法测定的呈色反应往往不稳定,因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生O2·过 程中消耗O2,一定量的SOD又会使O2ˉ·歧化产生O2,从而使耗氧量减少的特性,使用极谱氧电极仪精 确测出耗氧量而推算出酶活。SOD活力单位定义为:25℃,pH8.4,使每分钟产生1μlO2的SOD量定为 1个酶活力单位。 该方法利用了O2张力的变化,与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无 关,尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定O2量,方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好 且可自动连续记录酶作用过程的变化。 除了以上几种方法,其他方法如光化学法(正染法)等方法也都得到不断的改进:而灵敏度、特异性 均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用,并取得了很好效果。同时计算机也开始用于SOD的活 性分析,并有用于SOD酶活力线性分析的专用软件,可适用于各种产O2-·系统、各种清除剂系统及不同 的酶提取液的活力测定 (二)过氧化氢藤( catalase,CAT) 过氧化氢酶是另一种酶类清除剂,又称为触酶,是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使HO2分解为分 子氧和水,清除体内的过氧化氢,从而使细胞免于遭受H2O2的毒害,是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是HO2的歧化,必须有两个HO先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上,才能
9 国外多以该法测定 SOD 活性。在 SOD 被发现之初就是利用此法进行测定的，又称之为 McCord 法， 被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为：在一定条件下，3ml 反应液中，每分钟抑制氧化型细 胞色素 C 还原率达 50%的酶量定为一个活力单位。 McCord 法灵敏度较低，但采取以下措施可得到提高: ①用乙酰化细胞色素 C 替代细胞色素 C，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素 C 氧化酶的影响； ②将 pH7.8，0.05mo1/L 磷酸缓冲液换成 pH10.2 的碳酸缓冲液，并将黄嘌呤浓度从 0.05 mmo1/L 增至 0.10 mmo1/L ，灵敏度可提高 10 倍； ③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在 25℃下保温 10 分钟，使 O2 －·产量达到稳定程度，即 O2 －·产 生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达 710 倍； ④利用 FP9 平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。 （2）邻苯三酚自氧化法 国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法（简称 Marklund 法），Marklund 法是采用 420nm 处光吸收测定。 酶活力定义为：在一定条件下 1ml 的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在 420nm 波长的自氧化速率达 50% 的酶量定为一个活力单位。 该方法经过不断改进，操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由 420nm 改用 325nm，测试灵敏度 提高了 6.4 倍，称为微量邻苯三酚自氧化法，同时将邻苯三酚耗量减少一半； Marklund 法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行，因此样品池必须保持恒温，且不 能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇（DTT）或 L-抗坏血酸（VC ）作为终止剂，使反应暂时停止， 使 A420 在一定时间内保持恒定，可同时测多个样品，有较高的重复性和回收率。同时，终止剂既不参与， 也不影响邻苯三酚的呈色反应，自氧化曲线与经典法的相吻合，最大抑制百分比和灵敏度也基本一致。 另外，为消除 HCl 对 SOD 的抑制作用，改用 K2HPO4- KH2PO4 缓冲液替代 Tris - HCl 缓冲液，灵敏度 可提高 50%。 （3）化学发光法 化学发光法依据的原理是：O2 －·可与化学发光剂鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅 速返回基态时，即发出光。SOD 可消除 O2 －·，从而使发光强度降低，SOD 浓度与发光百分率在一定时间 内呈线性关系。活力单位定义为：在一定条件下，使每毫升反应液于 1 分钟末发光率被抑制 50%的酶量作 为一个酶活力。 同传统的比色法相比较，化学发光法专一性较强，其他干扰因素少，灵敏度高，最适用作粗提取液中 SOD 活性的检测。 （4）极谱氧电极法 比色法测定的呈色反应往往不稳定，因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生 O2 －·过 程中消耗 O2，一定量的 SOD 又会使 O2 －·歧化产生 O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精 确测出耗氧量而推算出酶活。SOD 活力单位定义为：25℃， pH8.4，使每分钟产生 1μl O2的 SOD 量定为 1 个酶活力单位。 该方法利用了 O2 张力的变化，与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无 关，尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定 O2 量，方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好， 且可自动连续记录酶作用过程的变化。 除了以上几种方法，其他方法如光化学法（正染法）等方法也都得到不断的改进；而灵敏度、特异性 均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用，并取得了很好效果。同时计算机也开始用于 SOD 的活 性分析，并有用于 SOD 酶活力线性分析的专用软件，可适用于各种产 O2 －·系统、各种清除剂系统及不同 的酶提取液的活力测定。 （二）过氧化氢酶（catalase，CAT） 过氧化氢酶是另一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使 H2O2 分解为分 子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受 H2O2 的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是 H2O2 的歧化，必须有两个 H2O2 先后与 CAT 相遇且碰撞在活性中心上，才能
发生反应。H2O2浓度越高,分解速度越快。 几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内,主要存在于植物的叶绿体 线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中,其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 CAT是红血素酶,不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏 中分解速度比在脑或心脏等器官快,就是因为肝中的CAT含量水平高。 自1937年首次推出作为细胞内结晶化酶之一的牛肝过氧化氢酶之后,已利用不同方法(选择性沉淀 法和层析法)从牛、马或人的红细胞、肝和肾中提纯过氧化氢酶。从不同机体分离出的大多数过氧化氢酶 的分子量为240kDa,并具有4个相同的亚单位,在其活性部位各含一血红素基团。来自哺乳动物以及某些 真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4个紧密结舍的 NADPH分子,但其功能尚有争议。 常用的CAT酶活性测定方法有以下几类 (1)分光光度法包括钼酸铵比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法简便,快 速,显色稳定,重复性好,不需特殊试剂及仪器设备,适合一般实验室采用,但生物样品常会造成干扰 (2)化学发光法鲁米诺( luminol)在一定条件下与HO2及Co2等金属离子共存时发出强烈的蓝光, 当样品中有CAT存在时,基质的H2O2将被分解,由H2O2所引起的化学发光强度减弱,由此计算总CAT酶活 性。化学发光法易受试剂配制、操作技术和条件及测定时间等多种因素影响,但经过方法改进,可排除各 种不良因素对测定的影响,是一种简单灵敏、重复性好、特异性也较高的化学发光技术测定方法; (3)极谱法溶液中两个电极间加以一定的电压(极化电压)后产生可测电流,极谱法是应用氧电 极,通过测量这种电解电流量以测定溶质的方法。当反应体系中含有一定浓度的过氧化氢时,加入一定量 的含有过氧化氢酶的样品,过氧化氢就被分解而产生氧气,记录仪上可显示出反应室中氧量增加,增加的 程度与加入液体中酶的活性成正比。该方法广泛用于生化方面的研究工作; (4)滴定法包括:①过硼酸盐底物法:在中性水溶液中,CAT催化过硼酸盐还原成硼酸盐,同时释 出氧。经过一定时间后,加入硫酸使酶失活,以中止反应,用高锰酸钾溶液滴定残存的过硼酸盐,结果反 映CAT活性;②过氧化氢滴定法;一定量的细菌同一定量的HO2发生反应,经过一定时间后加酸中止反应, 然后用高锰酸钾滴定剩余的HO2量,从而测定细菌过氧化氢酶的活性。 (5)检压测定法在一定p的缓冲液中,过氧化氢酶作用于过氧化氢释出氧气。此反应非常迅速 剧烈,在不断搅拌、震荡及减压的条件下,所产生的氧气得以迅速逸出溶液,在一定容量的容器内产生压 力变化,压力变化数值可换算成产氧量,用来表示样品过氧化氢酶的活性。 (三)谷胱甘肽过氧化物醇(GPX) 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶,它于1957年被Mls首先发现, 但直到1973年才由Fohe和 Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系。 研究表明,硒是谷胱甘肽过氧化酶(Se-GPX)的活性成分,是GPX催化反应的必要组分,它以硒代 半胱氨酸(Sec)的形式发挥作用,摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降。在体内处于低硒水平时,活力与 硒的摄入量呈正相关,但到一定水平时,酶活力不再随硒水平上升而上升。 Se-GPX存在于胞浆和线粒体 基质中,它以谷胱甘肽(GSH)为还原剂分解体内的氢过氧化物,能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基 化合物,并使过氧化氢分解成醇和水,因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超 氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)一起构成了抗氧化防御体系,因而在机体抗氧化中发挥着重 要作用 机体在正常条件下,大部分活性氧被机体防御系统所清除,但当机体产生某些病变时,超量的活性氧 就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧O2ˉ·的第一道防线是超氧化物歧化酶(SOD),它将O2ˉ·转化 为过氧化氢和水,而第二道防线是过氧化氢酶(CAT)和GPX。CAT可清除H2O2,而GPX分布在细胞的 胞液和线粒体中,消除H2O2和氢过氧化物。因此,GPX、SOD和CAT协同作用,共同消除机体活性氧, 减轻和阻止脂质过氧化作用 GPX广泛存在于哺乳动物的组织中,不同种类的GPX其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此 酶的特异性专一底物,而氢过氧化物则是非专一性底物 GPX的活力测定常采用5,5′二硫代对二硝基苯甲酸(DINB)法,用单位时间内催化GSH氧化的 减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸(DINB)反应生成黄色的5-硫-2,2-硝基苯甲酸阴离子,在
10 发生反应。H2O2 浓度越高，分解速度越快。 几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、 线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 CAT 是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏 中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的 CAT 含量水平高。 自 1937 年首次推出作为细胞内结晶化酶之一的牛肝过氧化氢酶之后，已利用不同方法（选择性沉淀 法和层析法）从牛、马或人的红细胞、肝和肾中提纯过氧化氢酶。从不同机体分离出的大多数过氧化氢酶 的分子量为 240kDa，并具有 4 个相同的亚单位，在其活性部位各含一血红素基团。来自哺乳动物以及某些 真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结舍的 NADPH 分子，但其功能尚有争议。 常用的 CAT 酶活性测定方法有以下几类： （1）分光光度法 包括钼酸铵比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法简便，快 速，显色稳定，重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适合一般实验室采用，但生物样品常会造成干扰； （2）化学发光法 鲁米诺（luminol）在一定条件下与 H2O2及 Co2+等金属离子共存时发出强烈的蓝光， 当样品中有 CAT 存在时，基质的 H2O2 将被分解，由 H2O2 所引起的化学发光强度减弱，由此计算总 CAT 酶活 性。化学发光法易受试剂配制、操作技术和条件及测定时间等多种因素影响，但经过方法改进，可排除各 种不良因素对测定的影响，是一种简单灵敏、重复性好、特异性也较高的化学发光技术测定方法； （3）极谱法 溶液中两个电极间加以一定的电压（极化电压）后产生可测电流，极谱法是应用氧电 极，通过测量这种电解电流量以测定溶质的方法。当反应体系中含有一定浓度的过氧化氢时，加入一定量 的含有过氧化氢酶的样品，过氧化氢就被分解而产生氧气，记录仪上可显示出反应室中氧量增加，增加的 程度与加入液体中酶的活性成正比。该方法广泛用于生化方面的研究工作； （4）滴定法 包括:①过硼酸盐底物法：在中性水溶液中，CAT 催化过硼酸盐还原成硼酸盐，同时释 出氧。经过一定时间后，加入硫酸使酶失活，以中止反应，用高锰酸钾溶液滴定残存的过硼酸盐，结果反 映 CAT 活性；②过氧化氢滴定法；一定量的细菌同一定量的 H2O2 发生反应，经过一定时间后加酸中止反应， 然后用高锰酸钾滴定剩余的 H2O2 量，从而测定细菌过氧化氢酶的活性。 （5）检压测定法 在一定 pH 的缓冲液中，过氧化氢酶作用于过氧化氢释出氧气。此反应非常迅速、 剧烈，在不断搅拌、震荡及减压的条件下，所产生的氧气得以迅速逸出溶液，在一定容量的容器内产生压 力变化，压力变化数值可换算成产氧量，用来表示样品过氧化氢酶的活性。 （三）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX） 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于 1957 年被 Mills 首先发现， 但直到 1973 年才由 Flohe 和 Rotruck 两个研究小组确立了 GPX 与硒之间的联系。 研究表明，硒是谷胱甘肽过氧化酶（Se-GPX）的活性成分，是 GPX 催化反应的必要组分，它以硒代 半胱氨酸（Sec）的形式发挥作用，摄入硒不足时使 Se-GPX 酶活力下降。在体内处于低硒水平时，活力与 硒的摄入量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。Se-GPX 存在于胞浆和线粒体 基质中，它以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的氢过氧化物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基 化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超 氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）一起构成了抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重 要作用。 机体在正常条件下，大部分活性氧被机体防御系统所清除，但当机体产生某些病变时，超量的活性氧 就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧 O2 －·的第一道防线是超氧化物歧化酶（SOD），它将 O2 －·转化 为过氧化氢和水，而第二道防线是过氧化氢酶（CAT）和 GPX。CAT 可清除 H2O2，而 GPX 分布在细胞的 胞液和线粒体中，消除 H2O2 和氢过氧化物。因此，GPX、SOD 和 CAT 协同作用，共同消除机体活性氧， 减轻和阻止脂质过氧化作用。 GPX 广泛存在于哺乳动物的组织中，不同种类的 GPX 其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此 酶的特异性专一底物，而氢过氧化物则是非专一性底物。 GPX 的活力测定常采用 5，5′-二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）法，用单位时间内催化 GSH 氧化的 减少量表示。GSH 可和二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色的 5-硫-2,2-硝基苯甲酸阴离子，在