四、实验仪器、器材与试剂 1.材料:梨形四膜虫。 2.仪器:锥形瓶,相差显微镜,血细胞计数器,台式离心机,滴管,注射器, parafilm 膜,载玻片,盖玻片,定时器。 3.试剂:蛋白胨,亚胺环己酮,新霉素,秋水仙碱,EDIA,醋酸钠,氯化钙 五、实验方法与步骤 1、分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25℃和17℃培 养。(时间) 2、两瓶培养物分别800g离心10分钟,重新悬浮于15毫升1%蛋白胨溶液,置于50 毫升锥形瓶,做好标记。 3、准备2个50毫升锥形瓶,各加入15毫升1%蛋白胨溶液;3个100毫升锥形瓶,含 20毫升1%蛋白胨溶液,分别加入10微克/升亚胺环己酮:50微克升亚新霉素:加入2毫 克/升秋水仙碱 4、以下操作在冰浴上进行: )在零时间,用一个大试管在冰浴上将25毫升浓缩的四膜虫悬液(生长于25℃)加 至5毫升介质A(10mDTA·2Na;50wM醋酸钠;pH6.0)中,搅拌混匀。 2)30秒后加入2.5毫升预冷的蒸馏水。 3)1分钟后加入0.25毫升预冷的0. 2Mcacl, parafilm膜封口,倒转试管使之混合。 4)2分钟后用装有19号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中(修剪掉四膜虫的 纤毛)。迅速用滴灌取少量悬液,滴加在载玻片上镜检,观察其是否失去运动性 5)去纤毛后,立即把1毫升去纤毛的细胞加至20毫升1%蛋白胨溶液,25℃预热的100 毫升锥形瓶中,于25℃培养并开始实验。 5、每隔10分钟取出定量的样品,对其随时间变化的能动性( motility)%进行分析。由 于脱纤毛的细胞不能运动,切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察,估计运动细 胞和非运动细胞的数目。制备快速标本,在相差显微镜下观察细胞是否肿胀,有无新生纤毛 等情况。 6、同时对生长于17℃的四膜虫进行脱纤毛,并同在25℃的四膜虫的纤毛再生时间比 较 7、从生长于25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞,在分别加入亚胺环己酮,新霉9 四、实验仪器、器材与试剂 1．材料：梨形四膜虫。 2．仪器：锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm 膜，载玻片，盖玻片，定时器。 3．试剂：蛋白胨，亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA，醋酸钠，氯化钙。 五、实验方法与步骤 1、 分别将 250 毫升含 1%蛋白胨四膜虫培养物置于 500 毫升锥形瓶中于 25℃和 17℃培 养。（时间） 2、 两瓶培养物分别 800g 离心 10 分钟，重新悬浮于 15 毫升 1%蛋白胨溶液，置于 50 毫升锥形瓶，做好标记。 3、 准备 2 个 50 毫升锥形瓶，各加入 15 毫升 1%蛋白胨溶液；3 个 100 毫升锥形瓶，含 20 毫升 1%蛋白胨溶液，分别加入 10 微克/升亚胺环己酮；50 微克/升亚新霉素；加入 2 毫 克/升秋水仙碱。 4、 以下操作在冰浴上进行： 1） 在零时间，用一个大试管在冰浴上将 2.5 毫升浓缩的四膜虫悬液（生长于 25℃）加 至 5 毫升介质 A（10mMEDTA·2Na; 50mM 醋酸钠；pH6.0）中，搅拌混匀。 2） 30 秒后加入 2.5 毫升预冷的蒸馏水。 3） 1 分钟后加入 0.25 毫升预冷的 0.2McaCl2, parafilm 膜封口，倒转试管使之混合。 4） 2 分钟后用装有 19 号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中（修剪掉四膜虫的 纤毛）。迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。 5） 去纤毛后，立即把 1 毫升去纤毛的细胞加至 20 毫升 1%蛋白胨溶液，25℃预热的 100 毫升锥形瓶中，于 25℃培养并开始实验。 5、 每隔 10 分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性（motility）%进行分析。由 于脱纤毛的细胞不能运动，切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察，估计运动细 胞和非运动细胞的数目。制备快速标本，在相差显微镜下观察细胞是否肿胀，有无新生纤毛 等情况。 6、 同时对生长于 17℃的四膜虫进行脱纤毛，并同在 25℃的四膜虫的纤毛再生时间比 较。 7、 从生长于 25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉