非均相反应需要用到固相载体,首先要将抗原或抗体固定到固相载体上。常用的固相载体是 聚苯乙烯微孔板(酶标板),还有用聚乙烯、聚丙烯等材料制成的微孔板。此法常被称为Enme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) ①测抗体:将纯化的抗原固定到微孔板的孔中,加入不同稀释度的抗血清,待测抗体即和固 定的抗原结合,洗涤后,加入酶标的二抗(抗抗体),再洗去未结合的多余酶标二抗,加底物显色 比色,色度与抗体的量成正相关 ②测抗原: a.双抗夹心法:将抗体固定到微孔板的孔中,加入待测抗原,待测抗原与固定的抗体结合, 再加入酶标抗体,酶标抗体与待测抗原结合,洗去未结合的多余酶标抗体,加底物显色,比色, 色度与待测抗原的量成正相关。若上述酶标抗体换成非酶标抗体(必须与固定抗体不同,如分别 为鼠和兔来源),洗涤后再加上酶标二抗,可提高检测的灵敏度。此法适合于测定具有两个以上 抗原决定簇的抗原。 b.竞争法I:将抗体固定到微孔板的孔中,再加入待测抗原和一定量的酶标抗原,两种抗 原竞争与固定抗体结合,待测抗原多则结合上去的酶标抗原少,色度与待测抗原量成反相关。 c.竞争法Ⅱ:让游离的待测抗原和抗体在试管中反应,然后加到固定有纯化抗原的微孔板 的孔中,待测抗原多则结合到固定抗原上的抗体少,洗涤后加入酶标二抗。色度与待测抗原成反 相关。此法适合于测定只具有一个抗原决定簇的抗原 在非均相反应中,因有多次洗涤过程,待测抗原中若有酶的可逆抑制剂,影响不大。 (3)标记酶的选择 采用标记酶有放大作用,因为每一个酶分子可以催化许多底物转化成产物。理想的标记酶要 有下列特点 a.在抗原一抗体结合的最适pH条件下,酶有高的比活性 b.酶有一些可供共价偶联的反应基团,与抗原或抗体偶联后酶活性损失很小; c.酶活性不受测定液中各种因素的影响,抑制剂标记抗原的影响除外 d.酶反应的产物为有色物质,颜色稳定,便于比色检测 e.价廉(包括酶、底物) f.底物、酶、产物对人无害。 常用的标记酶有过氧化物酶,它价格便宜,是糖蛋白,可以用高碘酸活化法与抗原或抗体偶 联。防腐剂、氧化剂、还原剂会使该酶失活,所以反应体系中不能含有这些物质。用比色法可以 测出皮摩尔水平的酶,最灵敏的底物是邻苯二胺(同时加H2O),但其具有光敏性,应在弱光下使 用。另一种常用的标记酶是碱性磷酸酶非均相反应需要用到固相载体，首先要将抗原或抗体固定到固相载体上。常用的固相载体是 聚苯乙烯微孔板(酶标板)，还有用聚乙烯、聚丙烯等材料制成的微孔板。此法常被称为 Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA)。 ① 测抗体：将纯化的抗原固定到微孔板的孔中，加入不同稀释度的抗血清，待测抗体即和固 定的抗原结合，洗涤后，加入酶标的二抗(抗抗体)，再洗去未结合的多余酶标二抗，加底物显色， 比色，色度与抗体的量成正相关。 ② 测抗原： a. 双抗夹心法：将抗体固定到微孔板的孔中，加入待测抗原，待测抗原与固定的抗体结合， 再加入酶标抗体，酶标抗体与待测抗原结合，洗去未结合的多余酶标抗体，加底物显色，比色， 色度与待测抗原的量成正相关。若上述酶标抗体换成非酶标抗体(必须与固定抗体不同，如分别 为鼠和兔来源)，洗涤后再加上酶标二抗，可提高检测的灵敏度。此法适合于测定具有两个以上 抗原决定簇的抗原。 b. 竞争法Ⅰ：将抗体固定到微孔板的孔中，再加入待测抗原和一定量的酶标抗原，两种抗 原竞争与固定抗体结合，待测抗原多则结合上去的酶标抗原少，色度与待测抗原量成反相关。 c. 竞争法Ⅱ：让游离的待测抗原和抗体在试管中反应，然后加到固定有纯化抗原的微孔板 的孔中，待测抗原多则结合到固定抗原上的抗体少，洗涤后加入酶标二抗。色度与待测抗原成反 相关。此法适合于测定只具有一个抗原决定簇的抗原。 在非均相反应中，因有多次洗涤过程，待测抗原中若有酶的可逆抑制剂，影响不大。 (3) 标记酶的选择： 采用标记酶有放大作用，因为每一个酶分子可以催化许多底物转化成产物。理想的标记酶要 有下列特点： a. 在抗原—抗体结合的最适 pH 条件下，酶有高的比活性； b. 酶有一些可供共价偶联的反应基团，与抗原或抗体偶联后酶活性损失很小； c. 酶活性不受测定液中各种因素的影响，抑制剂标记抗原的影响除外； d. 酶反应的产物为有色物质，颜色稳定，便于比色检测； e. 价廉(包括酶、底物)； f. 底物、酶、产物对人无害。 常用的标记酶有过氧化物酶，它价格便宜，是糖蛋白，可以用高碘酸活化法与抗原或抗体偶 联。防腐剂、氧化剂、还原剂会使该酶失活，所以反应体系中不能含有这些物质。用比色法可以 测出皮摩尔水平的酶，最灵敏的底物是邻苯二胺(同时加 H2O2)，但其具有光敏性，应在弱光下使 用。另一种常用的标记酶是碱性磷酸酶