第十一章酶在医学方面的应用 酶工程在医学方面的应用是研究和解决酶在医学上应用时的各种技术问题。现代分子生物学 认为生物活动的正常进行都依赖于机体内部生化反应的平衡和稳定,这种复杂而有序的生化反应 需要酶来催化调节,以控制体内代谢的正常进行。因此,一旦疾病发生,究其根本原因都与酶有 直接或间接的关系。机体内部发生的疾病,往往由于酶的功能失调,把酶作为药物,补充酶的不 足,或调整酶的作用,可以达到治疗的目的。例如体内某一器官失调,使酶的分泌不足,或因基 因突变使酶分子结构改变,使酶丧失原有功能,都可以用酶来作补充治疗。体内许多有害物质的 积累,可用酶来清除。癌细胞的异常生化环境,可用酶来破坏。早期酶在医疗上的应用限于帮助 食物消化,问题较少;但进一步使用酶就遇到了不少问题。外来酶作为异源大分子物质,容易引 起过敏反应;酶在体内半衰期很短,一般只有几分钟,不能达到治疗目的;酶进入体内后必须使 之集中到治疗部位,以达到最高疗效。 酶除了用作治疗外,还可用于医学工程的某些组成部分,使之发挥医疗作用。如利用体外循 环装置清除血液中的某些废物时,酶就能发挥重要作用。将酶用作临床体外检测的试剂也是近年 来在医疗方面的一个重要贡献 由此可见酶在医学方面的应用有着广阔的前景。 11.1药用酶 用酶来治疗疾病最早是以淀粉酶为代表的各类口服消化用酶。1952年, Interfield将结晶胰 蛋白酶静脉注射治疗脉管炎获得成功。现在已经知道有药用价值的酶有近百种,但其中临床疗效 肯定,使用安全的品种不过30余种,随着酶的稳定性、副作用、给药方式及剂型的逐步改进 酶用于医疗的情况会越来越多。 11.1.1药用酶的分类 a.消化酶类:胃蛋白酶、胰酶、α一淀粉酶、胰脂肪酶、凝乳酶、乳糖酶 b.抗炎及清疮用酶:溶菌酶、超氧化物歧化酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链激酶、胶原酶、 胰蛋白酶、尿酸酶、尿素酶、a一糜蛋白酶 c.溶纤酶类:溶栓酶、尿激酶、链激酶、蚯蚓溶纤酶 d.心血管疾病用酶:激肽释放酶、弹性酶、促凝血酶原激酶、细胞色素C、辅酶Qo、辅酶A ε.遗传性缺酶症治疗用酶:氨基己糖酶Δ、α一半乳糖苷酶、β一葡萄糖脑苷酯酶、酸性麦 芽糖酶、苯丙氨酸氨基裂解酶 f.肿瘤治疗用酶:L-天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、羧基肽酶、L-亮氨酸脱水酶、L-精氨酸酶 11.1.2药用酶的固定化和给药方法
第十一章 酶在医学方面的应用 酶工程在医学方面的应用是研究和解决酶在医学上应用时的各种技术问题。现代分子生物学 认为生物活动的正常进行都依赖于机体内部生化反应的平衡和稳定，这种复杂而有序的生化反应 需要酶来催化调节，以控制体内代谢的正常进行。因此，一旦疾病发生，究其根本原因都与酶有 直接或间接的关系。机体内部发生的疾病，往往由于酶的功能失调，把酶作为药物，补充酶的不 足，或调整酶的作用，可以达到治疗的目的。例如体内某一器官失调，使酶的分泌不足，或因基 因突变使酶分子结构改变，使酶丧失原有功能，都可以用酶来作补充治疗。体内许多有害物质的 积累，可用酶来清除。癌细胞的异常生化环境，可用酶来破坏。早期酶在医疗上的应用限于帮助 食物消化，问题较少；但进一步使用酶就遇到了不少问题。外来酶作为异源大分子物质，容易引 起过敏反应；酶在体内半衰期很短，一般只有几分钟，不能达到治疗目的；酶进入体内后必须使 之集中到治疗部位，以达到最高疗效。 酶除了用作治疗外，还可用于医学工程的某些组成部分，使之发挥医疗作用。如利用体外循 环装置清除血液中的某些废物时，酶就能发挥重要作用。将酶用作临床体外检测的试剂也是近年 来在医疗方面的一个重要贡献。 由此可见酶在医学方面的应用有着广阔的前景。 11.1 药用酶 用酶来治疗疾病最早是以淀粉酶为代表的各类口服消化用酶。1952 年，Innerfield 将结晶胰 蛋白酶静脉注射治疗脉管炎获得成功。现在已经知道有药用价值的酶有近百种，但其中临床疗效 肯定，使用安全的品种不过 30 余种，随着酶的稳定性、副作用、给药方式及剂型的逐步改进， 酶用于医疗的情况会越来越多。 11.1.1 药用酶的分类 a. 消化酶类：胃蛋白酶、胰酶、α－淀粉酶、胰脂肪酶、凝乳酶、乳糖酶 b. 抗炎及清疮用酶：溶菌酶、超氧化物歧化酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链激酶、胶原酶、 胰蛋白酶、尿酸酶、尿素酶、α－糜蛋白酶 c. 溶纤酶类：溶栓酶、尿激酶、链激酶、蚯蚓溶纤酶 d. 心血管疾病用酶：激肽释放酶、弹性酶、促凝血酶原激酶、细胞色素 C、辅酶 Q10、辅酶 A e. 遗传性缺酶症治疗用酶：氨基己糖酶 A、α－半乳糖苷酶、β－葡萄糖脑苷酯酶、酸性麦 芽糖酶、苯丙氨酸氨基裂解酶 f. 肿瘤治疗用酶：L-天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、羧基肽酶、L-亮氨酸脱水酶、 L-精氨酸酶 11.1.2 药用酶的固定化和给药方法
长期以来药用酶的剂型是将纯化的天然酶制成口服、注射、或外用等制剂为主要给药方式。 但对于稳定性较差,在体半衰期很短的酶则治疗效果很差。特别是近年来发展的治疗遗传性缺酶 症、代谢紊乱症、肿瘤以及心血管病等的酶如能利用酶的固定化技术和新的给药方式,可使酶发 挥较大的作用。 (1)将酶以微囊、红细胞载体、人白蛋白载体等形式,通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等 方法引入体内,可以延长酶的半衰期,且使酶缓慢释放,提高酶的功效。红细胞膜上有许多小孔, 在溶血过程中小孔可以开放,使血红蛋白逸出,同时也能使其它蛋白进入胞内。如果用人工方法 使红细胞膨胀,可使酶进入红细胞内。制备方法如下 用酶液稀释经过清洗的红细胞,加入低渗盐水,使通过暂时胀大的细胞膜孔,进入细胞。然 后用高渗盐水恢复其等渗状态。再经多次离心洗涤除去剩余酶液。这种红细胞载体可以注入人体, 能将酶活力集中与肝脏(约70%),比较安全可靠。 (2)包埋的含酶颗粒可以经口服使酶在胃肠道释放,并与相应的底物反应,降低胃肠道中底物 的水平,从而间接降低血液中底物的水平。如口服尿素酶微囊可降低血中尿素的水平。 (3)配合体外循环装置将酶固定在微囊、玻璃球、尼龙管、纤维素、胶原蛋白等上面,安装在 透析器内,解决异体蛋白在体内引起的过敏问题。 人工肾是体外循环装置中最成功的代表。它是利用体外循环将患者的血液通过透析器除去代 谢废物(如尿素)后重新返回体内的一种装置。老式的人工肾需要体积庞大的透析液,既不经济又 不方便。1968年, T.M.S. Chang加以改进,将通过透析器的含尿素的透析液用泵输入到一个玻璃 柱内。柱的一端装有尿素酶微囊,另一端装有活性碳或离子交换剂。当透析液通过玻璃柱时,其 中的尿素受尿素酶作用转变为二氧化碳和氨,氨被活性碳吸附,二氧化碳回到血中由肺排出体外 活性碳也能除去血液中的其它废物。整个装置可以降低血液中的尿素达80%。此装置的优点是 体积小型化,透析液可以循环使用,使人工肾成为实用化的一种医疗器械 (4)使用微型植入式注射泵,是一种长期给药的方法。它能①使 血液入口 药物在血中的水平保持稳定,避免药物水平在血中波动太大;②避 小型透析器 免多次注射引起的局部感染和局部肿块的产生;③病人可以自由行 走:④药物可以集中于病灶局部。虽然优点很多,需要克服的问题 高子交换剂 也不少。一是由于注射泵植入体内,出了故障不便修复:二是异物植入容易引起反应,必须选择 合适的材料:三是药物与泵材料之间不能发生反应。目前使用钛合金制作泵体,硅橡胶管为泵管。 其动力初期是采用蓄电池,现在有一种利用氟一碳化合物的蒸气来推动泵的活塞,而蒸气的压力 则借助于体温。I型糖尿病人可使用微型植λ式注射泵注射胰岛素(Ⅱ型糖尿病为非胰岛素依赖 型)
长期以来药用酶的剂型是将纯化的天然酶制成口服、注射、或外用等制剂为主要给药方式。 但对于稳定性较差，在体半衰期很短的酶则治疗效果很差。特别是近年来发展的治疗遗传性缺酶 症、代谢紊乱症、肿瘤以及心血管病等的酶如能利用酶的固定化技术和新的给药方式，可使酶发 挥较大的作用。 (1) 将酶以微囊、红细胞载体、人白蛋白载体等形式，通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等 方法引入体内，可以延长酶的半衰期，且使酶缓慢释放，提高酶的功效。红细胞膜上有许多小孔， 在溶血过程中小孔可以开放，使血红蛋白逸出，同时也能使其它蛋白进入胞内。如果用人工方法 使红细胞膨胀，可使酶进入红细胞内。制备方法如下： 用酶液稀释经过清洗的红细胞，加入低渗盐水，使通过暂时胀大的细胞膜孔，进入细胞。然 后用高渗盐水恢复其等渗状态。再经多次离心洗涤除去剩余酶液。这种红细胞载体可以注入人体， 能将酶活力集中与肝脏(约 70％)，比较安全可靠。 (2) 包埋的含酶颗粒可以经口服使酶在胃肠道释放，并与相应的底物反应，降低胃肠道中底物 的水平，从而间接降低血液中底物的水平。如口服尿素酶微囊可降低血中尿素的水平。 (3) 配合体外循环装置将酶固定在微囊、玻璃球、尼龙管、纤维素、胶原蛋白等上面，安装在 透析器内，解决异体蛋白在体内引起的过敏问题。 人工肾是体外循环装置中最成功的代表。它是利用体外循环将患者的血液通过透析器除去代 谢废物(如尿素)后重新返回体内的一种装置。老式的人工肾需要体积庞大的透析液，既不经济又 不方便。1968 年，T.M.S.Chang 加以改进，将通过透析器的含尿素的透析液用泵输入到一个玻璃 柱内。柱的一端装有尿素酶微囊，另一端装有活性碳或离子交换剂。当透析液通过玻璃柱时，其 中的尿素受尿素酶作用转变为二氧化碳和氨，氨被活性碳吸附，二氧化碳回到血中由肺排出体外。 活性碳也能除去血液中的其它废物。整个装置可以降低血液中的尿素达 80％。此装置的优点是 体积小型化，透析液可以循环使用，使人工肾成为实用化的一种医疗器械。 (4) 使用微型植入式注射泵，是一种长期给药的方法。它能 ①使 药物在血中的水平保持稳定，避免药物水平在血中波动太大；②避 免多次注射引起的局部感染和局部肿块的产生；③病人可以自由行 走；④药物可以集中于病灶局部。虽然优点很多，需要克服的问题 也不少。一是由于注射泵植入体内，出了故障不便修复；二是异物植入容易引起反应，必须选择 合适的材料；三是药物与泵材料之间不能发生反应。目前使用钛合金制作泵体，硅橡胶管为泵管。 其动力初期是采用蓄电池，现在有一种利用氟—碳化合物的蒸气来推动泵的活塞，而蒸气的压力 则借助于体温。Ⅰ型糖尿病人可使用微型植入式注射泵注射胰岛素(Ⅱ型糖尿病为非胰岛素依赖 型)
(5)注入体内的酶,使之集中到某一部位以提高酶的疗效。如根据酶微囊颗粒的大小,可以使 微囊集中在某一器官或组织。用人白蛋白制成的酶微囊,直径在15~30μm以上,静注时可通 过心脏,进入肺部微血管,在此可集中99%的酶。如果是直径为1~3um的微囊,则静注后可 到达网状内皮系统,在此可集中90%的酶。再小于1um的颗粒则可在肝(80%)、脾(5~8%) 骨髓(1~2%)中依比例分布。还可以使微囊表面带上特殊物质(抗体、可识别物质)与特定组织细 胞表面的抗原或受体反应,达到定向给药的目的 112诊断用酶 诊断用酶是用来检测体内某些与疾病有关的代谢物质或与疾病有关的酶变化(化验),从而诊 断病情。酶法检测有快速、简便、正确、灵敏等优点,因而发展很快。对诊断用酶的要求比药用 酶低些,因其不用于体内,可以不考虑其抗原性和毒性;对纯度的要求是只要不含有能干扰所需 反应的物质即可,如脱氢酶中不能含有NADH氧化酶,激酶中不能含有肌激酶,葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶中不能有6-磷酸葡萄糖酸。化验所用的酶可以是来自微生物,也可以是来自动植物。不同 来源的同一种酶往往反应性质不同,例如从酵母中提取的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶只能利用辅酶Ⅱ (NADP)为反应时的受氢体,而从肠膜状明串珠菌来的葡萄糖-6磷酸脱氢酶则能利用辅酶Ⅰ (NAD)或辅酶Ⅱ(NADP)为反应时的受氢体;微生物来源的尿酸酶的最适反应pH为6~7,而 从牛肾提取的尿酸酶最适pH为9~10 11.2.1酶反应系统的建立 在大多数情况下,酶法分析需要一个以上的酶和一个以上的反应,才能达到检测的目的。例 如要测定血清中的胆固醇含量,首先要找到一个能作用于胆固醇的酶,如胆固醇氧化酶,反应以 后,产物之一是H2O2,再用过氧化物酶通过偶联反应,将HO2定量地与显色底物反应,生成有 色物质,色泽的深浅与胆固醇的含量成正比关系,用比色计测出500nm的光密度,即可计算出 胆固醇在样品中的含量。上述催化第一步反应的酶称为始发反应酶,催化第二步反应的酶称为指 示反应酶 始发反应:胆固醇+O2 钽固醇氧化酶 胆甾酮+H2O2 指示反应:H2O2+显色底物过氧化有色物质+H2O 原合成一种有色物质,如酚和+氨基安替比林, 显色底物又叫色原,对于测H2O2来说色原有两类,第一类为单 色原,常用的有邻苯二酚、邻联(二)茴香胺及2,2-连氮基双(3-乙苯(= 并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABIS)。第二类为双色素原,即由两种色素 4-氮基安替 3- methyl-2- benzothiazolinone hydrazone(MBTH)和二甲基苯胺。 指示反应的产物应便于检测,常用于检测的指示反应产物是:有色物质、有紫外吸收的物质
(5) 注入体内的酶，使之集中到某一部位以提高酶的疗效。如根据酶微囊颗粒的大小，可以使 微囊集中在某一器官或组织。用人白蛋白制成的酶微囊，直径在 15～30μm 以上，静注时可通 过心脏，进入肺部微血管，在此可集中 99％的酶。如果是直径为 1～3μm 的微囊，则静注后可 到达网状内皮系统，在此可集中 90％的酶。再小于 1μm 的颗粒则可在肝(80％)、脾(5～8％)、 骨髓(1～2％)中依比例分布。还可以使微囊表面带上特殊物质(抗体、可识别物质)与特定组织细 胞表面的抗原或受体反应，达到定向给药的目的。 11.2 诊断用酶 诊断用酶是用来检测体内某些与疾病有关的代谢物质或与疾病有关的酶变化(化验)，从而诊 断病情。酶法检测有快速、简便、正确、灵敏等优点，因而发展很快。对诊断用酶的要求比药用 酶低些，因其不用于体内，可以不考虑其抗原性和毒性；对纯度的要求是只要不含有能干扰所需 反应的物质即可，如脱氢酶中不能含有 NADH 氧化酶，激酶中不能含有肌激酶，葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶中不能有 6-磷酸葡萄糖酸。化验所用的酶可以是来自微生物，也可以是来自动植物。不同 来源的同一种酶往往反应性质不同，例如从酵母中提取的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶只能利用辅酶Ⅱ (NADP ＋ )为反应时的受氢体，而从肠膜状明串珠菌来的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶则能利用辅酶Ⅰ (NAD＋ )或辅酶Ⅱ(NADP＋ )为反应时的受氢体；微生物来源的尿酸酶的最适反应 pH 为 6～7，而 从牛肾提取的尿酸酶最适 pH 为 9～10。 11.2.1 酶反应系统的建立 在大多数情况下，酶法分析需要一个以上的酶和一个以上的反应，才能达到检测的目的。例 如要测定血清中的胆固醇含量，首先要找到一个能作用于胆固醇的酶，如胆固醇氧化酶，反应以 后，产物之一是 H2O2，再用过氧化物酶通过偶联反应，将 H2O2 定量地与显色底物反应，生成有 色物质，色泽的深浅与胆固醇的含量成正比关系，用比色计测出 500nm 的光密度，即可计算出 胆固醇在样品中的含量。上述催化第一步反应的酶称为始发反应酶，催化第二步反应的酶称为指 示反应酶。 始发反应： 胆固醇 ＋ O2 胆固醇氧化酶 —————→ 胆甾酮 ＋ H2O2 指示反应： H2O2 ＋ 显色底物 过氧化物酶 ————→ 有色物质 ＋ H2O 显色底物又叫色原，对于测 H2O2 来说色原有两类，第一类为单 一色原，常用的有邻苯二酚、邻联(二)茴香胺及 2,2'-连氮基-双(3-乙苯 并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)。第二类为双色素原，即由两种色素 原合成一种有色物质，如酚和 4- 氨基安替比林、 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone(MBTH)和二甲基苯胺。 指示反应的产物应便于检测，常用于检测的指示反应产物是：有色物质、有紫外吸收的物质
(NDAH),使pH发生变化的物质。因为H2O2有上述指示反应,所以常利用可以产生H2O2的始 发反应。 NAD(P)H在340nm处有光吸收,而NAD(P)没有,用紫外比色可以测定 NAD(P)H的 变化,所以产生或消耗NADP)H的反应也可作为指示反应。若没有适当的始发反应可以利用, 可在始发反应与指示反应之间加一个或两个中间反应 a.肌酸激酶的测定: 始发反应: ADP 机酸微酶 中间反应:ATP+葡萄糖匚6磷酸葡萄糖+ADP 指示反应:6-磷酸葡萄糖十NAD鬣6-磷酸葡萄糖酸+NADH 酶法测定甘油三酯 始发反应:甘油三酯甘油+脂肪酸 中间反应I:甘油+ATP甘酶甘油-3-磷酸+ADP 中间反应Ⅱ:ADP+PEP 丙削酸微酶 丙酮酸+ATP 指示反应:丙酮酸+NADH乳酸氢乳酸+NAD 11.22底物测定原理 1122.1平衡法 平衡法是测定酶反应达到平衡时的产物生成量。该法要考虑反应的平衡常数、达到平衡点所 需要的时间、所需的酶量和辅酶或辅反应物的量。设反应如下: s+cm,P+式中S代表待测底物,C是辅酶或辅反应物,P和Q是反应产物。 反应达到平衡时用掉的底物比例越高,测定的结果越精确。反应的平衡常数越大,辅酶或辅反应 物与底物的浓度比越大,平衡时用掉的底物就越多(表9.1)。 表9.1达到所述百分转化率所需的C:S0比率 百分转化率 (Co:So比率) 99.5% 200 5 99.9% 1000 200 100 20 平衡常数大时所需辅酶或辅反应物的量就少。在低Ks值时要求非常高的Co:So比率,但在 实际使用时,Co太高可能会不溶解,也可能会对酶产生抑制作用。在低Keq值时可以加入某种
(NDAH)，使 pH 发生变化的物质。因为 H2O2 有上述指示反应，所以常利用可以产生 H2O2 的始 发反应。NAD(P)H 在 340nm 处有光吸收，而 NAD(P)＋没有，用紫外比色可以测定 NAD(P)H 的 变化，所以产生或消耗 NAD(P)H 的反应也可作为指示反应。若没有适当的始发反应可以利用， 可在始发反应与指示反应之间加一个或两个中间反应。 a. 肌酸激酶的测定： 始发反应： ＋ ADP 肌酸激酶 ———→ 肌酸 ＋ ATP 中间反应： ATP ＋ 葡萄糖 己糖激酶 ———→ 6-磷酸葡萄糖 ＋ ADP 指示反应：6-磷酸葡萄糖 ＋ NAD 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 ————————→ 6-磷酸葡萄糖酸 ＋ NADH b. 酶法测定甘油三酯： 始发反应： 甘油三酯 脂肪酶 ——→ 甘油 ＋ 脂肪酸 中间反应Ⅰ： 甘油 ＋ ATP 甘油激酶 ———→ 甘油-3-磷酸 ＋ ADP 中间反应Ⅱ： ADP ＋ PEP 丙酮酸激酶 ————→ 丙酮酸 ＋ ATP 指示反应： 丙酮酸 ＋ NADH 乳酸脱氢酶 ————→ 乳酸 ＋ NAD 11.2.2 底物测定原理 11.2.2.1 平衡法 平衡法是测定酶反应达到平衡时的产物生成量。该法要考虑反应的平衡常数、达到平衡点所 需要的时间、所需的酶量和辅酶或辅反应物的量。设反应如下： 式中 S 代表待测底物，C 是辅酶或辅反应物，P 和 Q 是反应产物。 反应达到平衡时用掉的底物比例越高，测定的结果越精确。反应的平衡常数越大，辅酶或辅反应 物与底物的浓度比越大，平衡时用掉的底物就越多(表 9.1)。 表 9.1 达到所述百分转化率所需的 C0 : S0 比率 百分转化率 Keq 1 5 10 20 （C0 : S0 比率） 99.0％ 100 20 10 1 99.5％ 200 40 20 5 99.9％ 1000 200 100 20 平衡常数大时所需辅酶或辅反应物的量就少。在低 Keq 值时要求非常高的 C0 : S0 比率，但在 实际使用时，C0 太高可能会不溶解，也可能会对酶产生抑制作用。在低 Keq 值时可以加入某种
能与产物之一反应的物质,从反应混合物中除去产物之一,而使反应进行得更为彻底。 在最适反应条件下达到反应平衡所需的时间与酶量有关,酶量多则达到反应平衡所需的时间 短。应采用在适当时间内达到平衡所需的酶量 1122.2动力学法 60年代初以来,出现了各种连续动力学分析仪,这些仪器一般是通过若干固定的时间间隔 对反应的进程进行跟踪,检验曲线的线性部分,并打印出反应的初速度,根据反应的初速度计算 出底物浓度。此方法的灵敏度随着底物浓度的增加而明显降低,因此S0=Km是动力学法应用的 上限 11.2.3酶活性测定原理 当底物浓度远大于酶浓度时,测定反应的初速度,可得到酶浓度 11.24干试纸条 将测定底物所需的酶和其它物质按一定次序铺在试纸(或塑料片)上,滴上待测溶液或将试纸 条浸入待测溶液中,就会产生颜色变化,将产生的颜色与标准色版比较,可得到测定结果 如图是尿素干试纸条的结构。当一滴血清滴到尿素干试纸条上时,样品首先同多孔的扩散层 接触,通过毛细作用快速均匀地扩散开来。扩散层下面是试剂层,此层含有结合在明胶上的脲酶 和缓冲剂。脲酶催化尿素水解成氨和CO2,然后氨通过半透膜扩散到 扩层(奸维◆二化〕 指示剂层,在此产生颜色。干试纸条还可用于测定葡萄糖、尿酸、胆固明试《冲 醇、甘油三酯等 指示剂层(酸纤维震+无色染料 透明光持物 112.5酶电极 酶电极又叫生物分析探针,它是由一种电化学传感器和一层固定化酶层及一到两层滤膜组 成,用来测定某些物质的含量。待测物通过滤膜扩散到固定化酶层,经酶催化转变成产物,产物 再扩散到电化学传感器表面发生电化学反应,产生电信号,此电信号经放大后用电流表或电压表 指示出来,或用记录仪记录下来。若用电流表示,被测物质的浓度与电流成线性关系:若用电压 表示,则被测物质的浓度与电压成对数关系。 不时称 化学传感器又称为电极,不同的电极对不同的物质敏感。根 多孔 据敏感物质的不同,电极分为氧电极、H2O2电极、氨电极、CO2电 极、pH电极等。对底物专一性强并能产生这些敏感物质的酶与相应 H2电 的电极组合,就可用来测定相应的底物。实用的酶电极要求专一性 强,灵敏度高,抗干扰能力强。成熟的酶电极是测葡萄糖的酶电极,其结构见右图。 图中的外膜由聚碳酸酯制作。它允许葡萄糖、氧气及其它小分子物质透过,不允许细胞和大 分子物质透过。固定的葡萄糖氧化酶催化的反应为:
能与产物之一反应的物质，从反应混合物中除去产物之一，而使反应进行得更为彻底。 在最适反应条件下达到反应平衡所需的时间与酶量有关，酶量多则达到反应平衡所需的时间 短。应采用在适当时间内达到平衡所需的酶量。 11.2.2.2 动力学法 60 年代初以来，出现了各种连续动力学分析仪，这些仪器一般是通过若干固定的时间间隔 对反应的进程进行跟踪，检验曲线的线性部分，并打印出反应的初速度，根据反应的初速度计算 出底物浓度。此方法的灵敏度随着底物浓度的增加而明显降低，因此 S0＝Km是动力学法应用的 上限。 11.2.3 酶活性测定原理 当底物浓度远大于酶浓度时，测定反应的初速度，可得到酶浓度。 11.2.4 干试纸条 将测定底物所需的酶和其它物质按一定次序铺在试纸(或塑料片)上，滴上待测溶液或将试纸 条浸入待测溶液中，就会产生颜色变化，将产生的颜色与标准色版比较，可得到测定结果。 如图是尿素干试纸条的结构。当一滴血清滴到尿素干试纸条上时，样品首先同多孔的扩散层 接触，通过毛细作用快速均匀地扩散开来。扩散层下面是试剂层，此层含有结合在明胶上的脲酶 和缓冲剂。 脲酶催化尿素水解成氨和 CO2，然后氨通过半透膜扩散到 指示剂层，在此产生颜色。干试纸条还可用于测定葡萄糖、尿酸、胆固 醇、甘油三酯等。 11.2.5 酶电极 酶电极又叫生物分析探针，它是由一种电化学传感器和一层固定化酶层及一到两层滤膜组 成，用来测定某些物质的含量。待测物通过滤膜扩散到固定化酶层，经酶催化转变成产物，产物 再扩散到电化学传感器表面发生电化学反应，产生电信号，此电信号经放大后用电流表或电压表 指示出来，或用记录仪记录下来。若用电流表示，被测物质的浓度与电流成线性关系；若用电压 表示，则被测物质的浓度与电压成对数关系。 电化学传感器又称为电极，不同的电极对不同的物质敏感。根 据敏感物质的不同，电极分为氧电极、H2O2 电极、氨电极、CO2 电 极、pH 电极等。对底物专一性强并能产生这些敏感物质的酶与相应 的电极组合，就可用来测定相应的底物。实用的酶电极要求专一性 强，灵敏度高，抗干扰能力强。成熟的酶电极是测葡萄糖的酶电极，其结构见右图。 图中的外膜由聚碳酸酯制作。它允许葡萄糖、氧气及其它小分子物质透过，不允许细胞和大 分子物质透过。固定的葡萄糖氧化酶催化的反应为：
葡萄糖十O2氧葡萄糖酸+H2O2 反应产物H2O2扩散透过醋酸纤维制成的内膜,在铂电极(阳极)处发生下列反应 H2O O2+2H+2e 醋酸纤维内膜的孔更小,其截留分子量为100。该膜可以阻止葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、以 及大部分其它可能产生干扰的物质到达电极 酶电极用于临床检验有许多优点:检测快速、灵敏度高、取样量少、费用低、携带方便。使 用时主要应注意干扰物质的影响 1.26酶法免疫测定(EIA 利用抗原抗体反应的专一性,可以进行一些物质的测定,被测定的物质既可以是抗原,也可 是抗体。酶法免疫测定可分为均相反应和非均相反应两类。 1126.1均相反应 均相反应在检测时不需要分离抗原、抗体或抗原抗体复合物,方法简便、快捷。此方法的基 本原理是用一定量的酶标抗原和未知量的游离抗原(待测抗原)竞争性地与有限量的抗体反应,然 后又分为两种情况:一是酶标抗原上的酶有活性,与抗体形成酶一抗原一抗体复合物后酶失去活 性。这样,当待测抗原多时,抗原抗体复合物中的酶标抗原就少,游离的酶标抗原多,体系中的 酶活性高:待测抗原少时,抗原抗体复合物中的酶标抗原就多,游离的酶标抗原少,体系中的酶 活性低。通过加入显色底物后比色,可测出酶活性的大小,从而得知待测抗原的多少。在这种情 况下,酶活性与待测抗原的量成正相关。二是酶标抗原上的酶失去活性,与抗体形成酶一抗原 抗体复合物后酶恢复活性。这样,当待测抗原多时,抗原抗体复合物中的酶标抗原就少,恢复的 酶活性也少,体系中的酶活性低;待测抗原少时,抗原抗体复合物中的酶标抗原就多,恢复的酶 活性也多,体系中的酶活性高。这种情况下是酶活性与待测抗原的量成反相关。第二种情况的例 子如甲状腺素一苹果酸脱氢酶结合物中的酶没有活性,与甲状腺素的抗体结合后酶恢复活性。 还有两种情况是不用酶标抗原,一种是用底物标记抗原,与待测抗原及抗体反应后,加入游 离酶,游离的底物标记抗原具有底物活性,可被酶催化形成产物,而与抗体形成底物一抗原一抗 体复合物的不具有底物活性。产物的量与待测抗原的量成正相关。这种方法因没有放大作用,灵 敏度较差,但若能产生荧光产物可补偿这个缺点。如伞形酮一艮他霉素可被β一半乳糖苷酶水解 产生荧光产物。二是用酶抑制剂标记抗原,如甲状腺素在同磷酸盐共价结合后,就可成为胆碱酯 酶的不可逆抑制剂,但磷酸化的甲状腺素在与甲状腺素的抗体结合后,就不能抑制胆碱酯酶。当 体系中含有一定量的游离酶时,剩余的酶活性与待测抗原成反相关。 因为待测抗原往往是混合物(如血清),若其中含有酶抑制剂,会影响测定结果。 112.62非均相反应
葡萄糖 ＋ O2 葡萄糖氧化酶 —————→ 葡萄糖酸 ＋ H2O2 反应产物 H2O2 扩散透过醋酸纤维制成的内膜，在铂电极(阳极)处发生下列反应： H2O2 —→ O2 ＋ 2H＋＋ 2e 醋酸纤维内膜的孔更小，其截留分子量为 100。该膜可以阻止葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、以 及大部分其它可能产生干扰的物质到达电极。 酶电极用于临床检验有许多优点：检测快速、灵敏度高、取样量少、费用低、携带方便。使 用时主要应注意干扰物质的影响。 11.2.6 酶法免疫测定(EIA) 利用抗原抗体反应的专一性，可以进行一些物质的测定，被测定的物质既可以是抗原，也可 以是抗体。酶法免疫测定可分为均相反应和非均相反应两类。 11.2.6.1 均相反应 均相反应在检测时不需要分离抗原、抗体或抗原抗体复合物，方法简便、快捷。此方法的基 本原理是用一定量的酶标抗原和未知量的游离抗原(待测抗原)竞争性地与有限量的抗体反应，然 后又分为两种情况：一是酶标抗原上的酶有活性，与抗体形成酶—抗原—抗体复合物后酶失去活 性。这样，当待测抗原多时，抗原抗体复合物中的酶标抗原就少，游离的酶标抗原多，体系中的 酶活性高；待测抗原少时，抗原抗体复合物中的酶标抗原就多，游离的酶标抗原少，体系中的酶 活性低。通过加入显色底物后比色，可测出酶活性的大小，从而得知待测抗原的多少。在这种情 况下，酶活性与待测抗原的量成正相关。二是酶标抗原上的酶失去活性，与抗体形成酶—抗原— 抗体复合物后酶恢复活性。这样，当待测抗原多时，抗原抗体复合物中的酶标抗原就少，恢复的 酶活性也少，体系中的酶活性低；待测抗原少时，抗原抗体复合物中的酶标抗原就多，恢复的酶 活性也多，体系中的酶活性高。这种情况下是酶活性与待测抗原的量成反相关。第二种情况的例 子如甲状腺素—苹果酸脱氢酶结合物中的酶没有活性，与甲状腺素的抗体结合后酶恢复活性。 还有两种情况是不用酶标抗原，一种是用底物标记抗原，与待测抗原及抗体反应后，加入游 离酶，游离的底物标记抗原具有底物活性，可被酶催化形成产物，而与抗体形成底物—抗原—抗 体复合物的不具有底物活性。产物的量与待测抗原的量成正相关。这种方法因没有放大作用，灵 敏度较差，但若能产生荧光产物可补偿这个缺点。如伞形酮—艮他霉素可被β－半乳糖苷酶水解 产生荧光产物。二是用酶抑制剂标记抗原，如甲状腺素在同磷酸盐共价结合后，就可成为胆碱酯 酶的不可逆抑制剂，但磷酸化的甲状腺素在与甲状腺素的抗体结合后，就不能抑制胆碱酯酶。当 体系中含有一定量的游离酶时，剩余的酶活性与待测抗原成反相关。 因为待测抗原往往是混合物(如血清)，若其中含有酶抑制剂，会影响测定结果。 11.2.6.2 非均相反应
非均相反应需要用到固相载体,首先要将抗原或抗体固定到固相载体上。常用的固相载体是 聚苯乙烯微孔板(酶标板),还有用聚乙烯、聚丙烯等材料制成的微孔板。此法常被称为Enme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) ①测抗体:将纯化的抗原固定到微孔板的孔中,加入不同稀释度的抗血清,待测抗体即和固 定的抗原结合,洗涤后,加入酶标的二抗(抗抗体),再洗去未结合的多余酶标二抗,加底物显色 比色,色度与抗体的量成正相关 ②测抗原: a.双抗夹心法:将抗体固定到微孔板的孔中,加入待测抗原,待测抗原与固定的抗体结合, 再加入酶标抗体,酶标抗体与待测抗原结合,洗去未结合的多余酶标抗体,加底物显色,比色, 色度与待测抗原的量成正相关。若上述酶标抗体换成非酶标抗体(必须与固定抗体不同,如分别 为鼠和兔来源),洗涤后再加上酶标二抗,可提高检测的灵敏度。此法适合于测定具有两个以上 抗原决定簇的抗原。 b.竞争法I:将抗体固定到微孔板的孔中,再加入待测抗原和一定量的酶标抗原,两种抗 原竞争与固定抗体结合,待测抗原多则结合上去的酶标抗原少,色度与待测抗原量成反相关。 c.竞争法Ⅱ:让游离的待测抗原和抗体在试管中反应,然后加到固定有纯化抗原的微孔板 的孔中,待测抗原多则结合到固定抗原上的抗体少,洗涤后加入酶标二抗。色度与待测抗原成反 相关。此法适合于测定只具有一个抗原决定簇的抗原 在非均相反应中,因有多次洗涤过程,待测抗原中若有酶的可逆抑制剂,影响不大。 (3)标记酶的选择 采用标记酶有放大作用,因为每一个酶分子可以催化许多底物转化成产物。理想的标记酶要 有下列特点 a.在抗原一抗体结合的最适pH条件下,酶有高的比活性 b.酶有一些可供共价偶联的反应基团,与抗原或抗体偶联后酶活性损失很小; c.酶活性不受测定液中各种因素的影响,抑制剂标记抗原的影响除外 d.酶反应的产物为有色物质,颜色稳定,便于比色检测 e.价廉(包括酶、底物) f.底物、酶、产物对人无害。 常用的标记酶有过氧化物酶,它价格便宜,是糖蛋白,可以用高碘酸活化法与抗原或抗体偶 联。防腐剂、氧化剂、还原剂会使该酶失活,所以反应体系中不能含有这些物质。用比色法可以 测出皮摩尔水平的酶,最灵敏的底物是邻苯二胺(同时加H2O),但其具有光敏性,应在弱光下使 用。另一种常用的标记酶是碱性磷酸酶
非均相反应需要用到固相载体，首先要将抗原或抗体固定到固相载体上。常用的固相载体是 聚苯乙烯微孔板(酶标板)，还有用聚乙烯、聚丙烯等材料制成的微孔板。此法常被称为 Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA)。 ① 测抗体：将纯化的抗原固定到微孔板的孔中，加入不同稀释度的抗血清，待测抗体即和固 定的抗原结合，洗涤后，加入酶标的二抗(抗抗体)，再洗去未结合的多余酶标二抗，加底物显色， 比色，色度与抗体的量成正相关。 ② 测抗原： a. 双抗夹心法：将抗体固定到微孔板的孔中，加入待测抗原，待测抗原与固定的抗体结合， 再加入酶标抗体，酶标抗体与待测抗原结合，洗去未结合的多余酶标抗体，加底物显色，比色， 色度与待测抗原的量成正相关。若上述酶标抗体换成非酶标抗体(必须与固定抗体不同，如分别 为鼠和兔来源)，洗涤后再加上酶标二抗，可提高检测的灵敏度。此法适合于测定具有两个以上 抗原决定簇的抗原。 b. 竞争法Ⅰ：将抗体固定到微孔板的孔中，再加入待测抗原和一定量的酶标抗原，两种抗 原竞争与固定抗体结合，待测抗原多则结合上去的酶标抗原少，色度与待测抗原量成反相关。 c. 竞争法Ⅱ：让游离的待测抗原和抗体在试管中反应，然后加到固定有纯化抗原的微孔板 的孔中，待测抗原多则结合到固定抗原上的抗体少，洗涤后加入酶标二抗。色度与待测抗原成反 相关。此法适合于测定只具有一个抗原决定簇的抗原。 在非均相反应中，因有多次洗涤过程，待测抗原中若有酶的可逆抑制剂，影响不大。 (3) 标记酶的选择： 采用标记酶有放大作用，因为每一个酶分子可以催化许多底物转化成产物。理想的标记酶要 有下列特点： a. 在抗原—抗体结合的最适 pH 条件下，酶有高的比活性； b. 酶有一些可供共价偶联的反应基团，与抗原或抗体偶联后酶活性损失很小； c. 酶活性不受测定液中各种因素的影响，抑制剂标记抗原的影响除外； d. 酶反应的产物为有色物质，颜色稳定，便于比色检测； e. 价廉(包括酶、底物)； f. 底物、酶、产物对人无害。 常用的标记酶有过氧化物酶，它价格便宜，是糖蛋白，可以用高碘酸活化法与抗原或抗体偶 联。防腐剂、氧化剂、还原剂会使该酶失活，所以反应体系中不能含有这些物质。用比色法可以 测出皮摩尔水平的酶，最灵敏的底物是邻苯二胺(同时加 H2O2)，但其具有光敏性，应在弱光下使 用。另一种常用的标记酶是碱性磷酸酶