第四章酶的结构和功能 41酶的活性中心 41.1酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中,只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可 以在肽链的一级结构上相距较远,但通过肽链的折叠、盘旋,使它们在空间上接近,形成活性中 心(或称活性部位)。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务,有些执行催化反应 的任务。我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链 基团称为必需基团 1960年, Koshland将酶分子中 的氨基酸残基或其侧链基团分成4 R163 类:接触残基(直接与底物接触 参与结合或催化的残基;右图中的 Rl、R2、R6、R8、R9、R163、R164、甚酸残基在空间上接近构成活性中心 残基分类 R165),辅助残基(对接触残基的功 能起辅助作用的残基,也位于活性中心:右图中的R4),结构残基(维持构象的残基,此为活性 中心以外的必需基团;右图中的R10、R162、R169),非贡献残基(或称非必需残基,非必需只 是对酶发挥活性而言,它们可能有其他作用,如识别自身物质、运输、防止降解等:右图中的 41.2酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽,形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合,发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合,疏水基团与疏水残基亲合,带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合 例如羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨 基酸时(苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸),反应速度很快。但是当有这些较大疏水基团 的氨基酸残基进入亚位点3~6时,就会减低酶对这些底物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识
1 第四章 酶的结构和功能 4.1 酶的活性中心 4.1.1 酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可 以在肽链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘旋，使它们在空间上接近，形成活性中 心（或称活性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务，有些执行催化反应 的任务。我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链 基团称为必需基团。 1960 年，Koshland 将酶分子中 的氨基酸残基或其侧链基团分成 4 类：接触残基（直接与底物接触， 参与结合或催化的残基；右图中的 R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、 R165），辅助残基（对接触残基的功 能起辅助作用的残基，也位于活性中心；右图中的 R4），结构残基（维持构象的残基，此为活性 中心以外的必需基团；右图中的 R10、R162、R169），非贡献残基（或称非必需残基，非必需只 是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如识别自身物质、运输、防止降解等；右图中的 R3、R5、R7）。 4.1.2 酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。 例如羧肽酶 A 催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨 基酸时（苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反应速度很快。但是当有这些较大疏水基团 的氨基酸残基进入亚位点 3～6 时，就会减低酶对这些底物的亲和力。说明羧肽酶 A 对底物的识
别和结合有多个位点。同时,苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争性抑制剂 42酶活性中心化学基团的鉴定 常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和x-光晶体衍射法。 ) N-C-coH)亚位点 亚仪点3 亚位点2 亚位点2 亚位点4 亚位点5 羧肽酶A活性中心的拓扑学 苯丙氪酸是反应的竟争性抑制剂 42.1化学修饰法 酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰,如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧 基等。如果一个基团是必需的,则被修饰后酶活性会大大下降,甚至完全失活 42.1.1使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非特异性试剂可以修饰特定的某种基团,但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果某种 基团只存在于活性中心,而其他部位没有,就可以用非特异性试剂修饰。如木瓜蛋白酶( papain) 分子中有7个半胱氨酸残基,其中的6个形成3对二硫键,只有一个以自由巯基的形式存在于活 性中心(Cys22-63,Cys56-95,(ysl53-200,自由Cys25;编号从N端开始往C端进行)。在这 种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来修饰,如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性中 心无任何特殊亲和力,但由于这种特殊情况,仍然得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结 果 另外,通过动力学实验证实,还有一个组氨酸残基的咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化 部位(木瓜蛋白酶共有212个氨基酸,有Hs81和Hs59两个Hs)。 Husain和Lowe用1,3-二 溴丙酮修饰木瓜蛋白酶,在pH56,1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白酶的活性。对修饰后的 酶进行氨基酸分析,发现少一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮(2-1C)的修饰实验中,发现修饰剂
2 别和结合有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶 A 的竞争性抑制剂。 4.2 酶活性中心化学基团的鉴定 常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和 x-光晶体衍射法。 4.2.1 化学修饰法 酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧 基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后酶活性会大大下降，甚至完全失活。 4.2.1.1 使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非特异性试剂可以修饰特定的某种基团，但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果某种 基团只存在于活性中心，而其他部位没有，就可以用非特异性试剂修饰。如木瓜蛋白酶（papain） 分子中有 7 个半胱氨酸残基，其中的 6 个形成 3 对二硫键，只有一个以自由巯基的形式存在于活 性中心（Cys22-63，Cys56-95，Cys153-200，自由 Cys25；编号从 N 端开始往 C 端进行）。在这 种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性中 心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结 果。 另外，通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化 部位（木瓜蛋白酶共有 212 个氨基酸，有 His81 和 His159 两个 His）。Husain 和 Lowe 用 1,3-二 溴丙酮修饰木瓜蛋白酶，在 pH5.6，1 克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白酶的活性。对修饰后的 酶进行氨基酸分析，发现少一个组氨酸。在用 1,3-二溴丙酮（2- 14C）的修饰实验中，发现修饰剂
连接了Cys25和Hs-159两个残基,因此知道了这两个基团之间的距离在5A以内。这个结论通 过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。 由于酶活性部位微环境的影响,活性中心的基团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性 中心以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性中心的Ser能优先地被C-碘乙 酸标记;牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸标记,其LyS4l的ε-NH可优先地 被氟二硝基苯标记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂的反应性很低。 要充分利用高反应性的情况 42.1.2差示标记法 这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中 心,使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团,然后透析除去保护剂(即竞争性抑制剂和底物), 再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中 +R一 R为非特异性试剂 R 十R→ P为竟争性抑制齐 R*为放射性标记的非特异性试剂 胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性 基团存在。ψ胰蛋白酶(Lys6-le7之间断 甘氨酰胺缩合 第一次修饰的胰酶 裂成为β胰蛋白酶;Lys6-le7和 苯甲眯存在下去除反应物和抑制剂 [4C]甘氨酰胺缩合 Lys13l-Ser32两处断裂成为a胰蛋白酶 去除反应物第二次修饰的肤酶*4 8M乐中 Lys6-Ile7 Lysl31-Ser 132 分离肽 去除反应物 切断 酶消化 Lysl76-Aspl77三处断裂成为中胰蛋白 酶)失去了水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键的能力,而保留了一般的酯酶活性,估计Aspl77
3 连接了 Cys-25 和 His-159 两个残基，因此知道了这两个基团之间的距离在 5 A 以内。这个结论通 过 x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。 由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性 中心以外的基团的反应性高或低。如 3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性中心的 Ser 能优先地被 14C-碘乙 酸标记；牛胰核糖核酸酶活性中心的 His 能优先地被碘乙酸标记，其 Lys-41 的ε－NH2 可优先地 被氟二硝基苯标记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂的反应性很低。 要充分利用高反应性的情况。 4.2.1.2 差示标记法 这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中 心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂和底物）， 再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中 心。 胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性 基团存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7 之间断 裂成为β胰蛋白酶； Lys6-Ile7 和 Lys131-Ser132 两处断裂成为α胰蛋白酶； Lys6-Ile7 、 Lys131-Ser132 和 Lys176-Asp177 三处断裂成为ψ胰蛋白 酶）失去了水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般的酯酶活性，估计 Asp177
的βCOOH可能与结合底物有关(与底物中的碱性氨基酸结合)。Ey和 Nagar的实验证明了 推测。他们用苯甲脒( benzamidine,CHsC(=NH)NH2)作为β胰蛋白酶的竞争 性抑制剂,以1-乙基3-二甲氨丙 亚胺为缩合剂 1-ethyl-3-dimethylaminoprop carbodiimide C2H5-N=C=N-(CH2)N(CH3)2), CH2-CH-C-0-C2H 以甘氨酰胺( glycine amide)为 修饰剂,以差示标记法证明了 甲基苯磺 苯丙氨酸 TPCK Aspl77是结合底物的一个基 团。酶的羧基与甘氨酰胺以酰胺mc2-cm2Bc2c0c2H2-CB2-CE2-Cn2<CB2-HC-CH1 键结合后几乎完全抑制了酶水 解N-a-苯甲酰基-L精氨酸乙 基苯磺酰赖氨酸乙酯CH WE(N- -benzoyl-L-arginine ethyl ester)的能力 有时加了保护剂后使有些活性中心外的可修饰基团不能被修饰,也有时不能完全阻止对活性 中心基团的修饰,这是差示标记法的缺点。 42.1.3亲和标记 A.Ks型亲和标记 亲和标记是以带有高反应性基团的底物类似物与酶的活性中心结合,然后高反应性基团与酶 活性中心的基团反应,形成共价结合,这称为Ks型亲和标记。如胰凝乳蛋白酶用TPCK亲和标 记,胰蛋白酶用TLCK亲和标记。再如磷酸丙糖异构酶的底物是,亲和标记物为。 B.Kcat型亲和标记 Kcat型修饰剂的专一性不仅取决于修饰剂与酶结合的亲和力,而且取决于它作为酶的底物 的有效性。这种修饰剂具有潜在的化学反应基团,当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的 基团,与酶的活性中心共价结合,因此这类化合 HO-CH2-C-CH2-(P [或BrCH2=C-CH 底物 亲和标记物
4 的β－COOH 可能与结合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。Eyl 和 Inagami 的实验证明了 上述 推测。他们用苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰蛋白酶的竞争 性抑制剂，以 1-乙基-3-二甲氨丙 基 碳 二 亚 胺 为 缩 合 剂 （ 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide ， C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2）， 以甘氨酰胺（glycine amide）为 修饰剂，以差示标记法证明了 Asp177 是结合底物的一个基 团。酶的羧基与甘氨酰胺以酰胺 键结合后几乎完全抑制了酶水 解 N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙 酯 （ N- α -benzoyl-L-arginine ethyl ester）的能力。 有时加了保护剂后使有些活性中心外的可修饰基团不能被修饰，也有时不能完全阻止对活性 中心基团的修饰，这是差示标记法的缺点。 4.2.1.3 亲和标记 A．Ks 型亲和标记 亲和标记是以带有高反应性基团的底物类似物与酶的活性中心结合，然后高反应性基团与酶 活性中心的基团反应，形成共价结合，这称为 Ks 型亲和标记。如胰凝乳蛋白酶用 TPCK 亲和标 记，胰蛋白酶用 TLCK 亲和标记。再如磷酸丙糖异构酶的底物是，亲和标记物为。 B．Kcat 型亲和标记 Kcat 型修饰剂的专一性不仅取决于修饰剂与酶结合的亲和力，而且取决于它作为酶的底物 的有效性。这种修饰剂具有潜在的化学反应基团，当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的 基团，与酶的活性中心共价结合，因此这类化合
物又称为“自杀底物( suicide substrate)”。如3,5/4,6-环己烯四醇B环氧化物具有与葡萄糖吡喃 环相似的结构,它对糖苷酶有很高的亲和力,分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化 作用下,发生类似底物质子化的变化而受到活化,变成对酶有高度反应活性的基团,能专一地不 可逆地作用不同来源的β葡萄糖苷酶 C.光亲和标记 个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶的活性中心,照光后受光解激活,产生高反应性 基团,与酶的活性中心共价结合。0 hy 常见的试剂是光解时给出高度易 R-C-CH R-M3—)R-N: 碳烯 硝烯 反应的碳烯的重氮化合物或硝烯 的叠氮化合物。 在植物生理学中,用氚偶氮一IAA作光亲和标记试剂,经紫外光照射后,从番茄茎细胞质膜 上分离出了IAA受体蛋白。 表、某些常用的修饰剂 氨基酸残基 修饰剂 C 汞制剂,如对氯汞苯甲酸;二硫化物,如5,5′—二硫二(2-硝基苯甲酸) 碘乙酰胺 L 24,6-三硝基苯磺酸:磷酸吡哆醛(±还原试剂如NaBH4) His 二乙基焦碳酸盐:光氧化 Ar 苯乙二醛;2,3-丁二酮 四硝基甲烷:N-乙酰咪唑 Trp ;N-溴代丁二酰亚胺 A9,Gu水溶性碳二亚胺+亲核试剂如Gly甲酯 鉴别化学修饰剂是否已经引入酶的10 with substrate 活性中心,有下列两个标准 No substrate a.酶活性的丧失程度与修饰的程度成正 比 degree of mo duficaf
5 物又称为“自杀底物（suicide substrate）”。如 3,5/4,6-环己烯四醇 B 环氧化物具有与葡萄糖吡喃 环相似的结构，它对糖苷酶有很高的亲和力，分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化 作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地不 可逆地作用不同来源的β－葡萄糖苷酶。 C．光亲和标记 一个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶的活性中心，照光后受光解激活，产生高反应性 基团，与酶的活性中心共价结合。 常见的试剂是光解时给出高度易 反应的碳烯的重氮化合物或硝烯 的叠氮化合物。 在植物生理学中，用氚偶氮—IAA 作光亲和标记试剂，经紫外光照射后，从番茄茎细胞质膜 上分离出了 IAA 受体蛋白。 表、某些常用的修饰剂 氨基酸残基 修 饰 剂 Cys 汞制剂，如对氯汞苯甲酸；二硫化物，如 5,5＇－二硫二（2-硝基苯甲酸）； 碘乙酰胺 Lys 2,4,6-三硝基苯磺酸；磷酸吡哆醛（±还原试剂如 NaBH4） His 二乙基焦碳酸盐；光氧化 Arg 苯乙二醛；2,3-丁二酮 Tyr 四硝基甲烷；N-乙酰咪唑 Trp 碘；N-溴代丁二酰亚胺 Asp, Glu 水溶性碳二亚胺＋亲核试剂如 Gly 甲酯 鉴别化学修饰剂是否已经引入酶的 活性中心，有下列两个标准： a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正 比
b.底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用 对化学修饰实验得出的结论应非常慎重,因为可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近, 由于空间位阻使得底物无法进入活性中心,从而表现出酶失去活性。活性中心往往有多个与底物 结合的基团,修饰其中的一个往往不能使酶失去活性,可能导致结合力减弱,也可能改变被结合 底物的专一性。被修饰的氨基酸残基的位号可通过肽链的部分消化分析得到 422动力学分析法 动力学分析法是利用改变酶反应介质的pH,观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含 有许多可解离的基团,p改变必然会影响这些基团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离 状态发生变化时,会直接影响到酶的催化能力。因此,通过pH~酶催化活性关系的研究,可能 得到与催化直接相关的某些基团的pK值,进而推断这些基团的种类 pK值的测定以后再述 各基团的pK值有一理论值,但由于微环境的影响,实测的pk值往往与理论值有偏差,导 致分析基团种类的困难,这时需要用其他方法辅助分析,如测该基团的解离热函△H,或加有机 溶剂,改变溶液的电导率,作pH依存关系实验,从pK的变化来协助推断基团种类。 表、各种氨基酸残基的pK值与解离热函△H 氨基酸残基 值 △H(J/mol) a一羧基 3.0~3.2 ±6.276 β一羧基(天冬氨酸) 3.0~4.2 ±6.276 Y一羧基(谷氨酸) ~4.4 ±6.276 酚羟基(酪氨酸) 9.8~10.4 ±25,104 SH基(半胱氨酸) 8.3~8.6 咪唑基(组氨酸) 5.6~7.0 28.870~31.380 氨基 7.6~8.4 41,840~54,392 a一氨基(胱氨酸) 6.5~8.5 ε一氨基(赖氨酸) 9.4~10.6 41,840~50,208 胍基(精氨酸) 116~12.6 50,208~54,392
6 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。 对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近， 由于空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出酶失去活性。活性中心往往有多个与底物 结合的基团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能导致结合力减弱，也可能改变被结合 底物的专一性。被修饰的氨基酸残基的位号可通过肽链的部分消化分析得到。 4.2.2 动力学分析法 动力学分析法是利用改变酶反应介质的 pH，观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含 有许多可解离的基团，pH 改变必然会影响这些基团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离 状态发生变化时，会直接影响到酶的催化能力。因此，通过 pH～酶催化活性关系的研究，可能 得到与催化直接相关的某些基团的 pK 值，进而推断这些基团的种类。 pK 值的测定以后再述。 各基团的 pK 值有一理论值，但由于微环境的影响，实测的 pK 值往往与理论值有偏差，导 致分析基团种类的困难，这时需要用其他方法辅助分析，如测该基团的解离热函△H，或加有机 溶剂，改变溶液的电导率，作 pH 依存关系实验，从 pK 的变化来协助推断基团种类。 表、各种氨基酸残基的 pK 值与解离热函△H 氨基酸残基 pK 值 △H（J/mol） α－羧基 3.0 ~ 3.2 ±6,276 β－羧基（天冬氨酸） 3.0 ~ 4.2 ±6,276 γ－羧基（谷氨酸） ~ 4.4 ±6,276 酚羟基（酪氨酸） 9.8 ~ 10.4 ±25,104 SH 基（半胱氨酸） 8.3 ~ 8.6 — 咪唑基（组氨酸） 5.6 ~ 7.0 28,870 ~ 31,380 α－氨基 7.6 ~ 8.4 41,840 ~ 54,392 α－氨基（胱氨酸） 6.5 ~ 8.5 — ε－氨基（赖氨酸） 9.4 ~ 10.6 41,840 ~ 50,208 胍基（精氨酸） 11.6 ~ 12.6 50,208 ~ 54,392
42.3x-光衍射分析法 通过多种方法相互印证,可得出正确的结论 43组成酶活性中心的重要化学基团 酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高,它们是Ser、Hs、Cys、Iyr、Asp、Glu、Ly 同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性中心含有丝氨酸残 基,称为丝氨酸蛋白酶;胃蛋白酶和木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸残基,称为半胱氨酸蛋白 酶。在脱氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以为未知活性中心基团的酶的研究提供 线索。 同位素标记活性中心基团后,用蛋白酶部分水解,得到同位素标记的肽段,分析其氨基酸顺 序,可以了解活性中心附近的氨基酸顺序 实验表明,同类酶不仅有相同的活性中心基团,而且附近的氨基酸顺序也很相似 表、一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 胰蛋白酶(牛) .Asp-Ser-Cys-GIn-Gly-Asp-"Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys 胰凝乳蛋白酶(牛)… Ser-Ser-Cys-Met-Gly- Asp-"Ser-Gly-Gly- Pro-Leu- Val-Cys-Lys-Lys-Asn… 弹性蛋白酶(猪)|… Ser-Gly- CvS-Gln-Gly-Asp- Ser-Gly-Gly-Pro-leu- His-Cys-Leu-al-Asin 凝血酶(牛) Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-"Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser- Pro 蛋白酶( S. griseus)|…… hr-Cys-Glu-Gly-Asp-* Ser-Gly- Gly-Pro- Met-Phe 表示有催化活性的丝氨酸残基 表、一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 木瓜蛋白酶…Pro-l- LyS-Asn- Glu-GIv- Ser-CyS-Gly-Ser" Cys-Trp… 无花果蛋白酶…o- lle-Arg-Gln- Glu-GIy- GIn-CyS-Gly-Ser-+ Cys-Trp 菠萝蛋白酶 Asn-GIn-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala- Cys-Trp *表示有催化活性的半胱氨酸残基
7 4.2.3 x-光衍射分析法 通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。 4.3 组成酶活性中心的重要化学基团 酶活性中心有 7 种氨基酸残基参加的频率最高，它们是 Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性中心含有丝氨酸残 基，称为丝氨酸蛋白酶；胃蛋白酶和木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸残基，称为半胱氨酸蛋白 酶。在脱氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以为未知活性中心基团的酶的研究提供 线索。 同位素标记活性中心基团后，用蛋白酶部分水解，得到同位素标记的肽段，分析其氨基酸顺 序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。 实验表明，同类酶不仅有相同的活性中心基团，而且附近的氨基酸顺序也很相似。 表、一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 胰蛋白酶（牛） …Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys… 胰凝乳蛋白酶（牛） …Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn… 弹性蛋白酶（猪） …Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn… 凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro… 蛋白酶（S. griseus） ………Thr-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Met-Phe…… *表示有催化活性的丝氨酸残基 表、一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序 酶 活性中心附近的氨基酸顺序 木瓜蛋白酶 …Pro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp… 无花果蛋白酶 …Pro-Ile-Arg-Gln-Glu-Gly-Gln-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp… 菠萝蛋白酶 …Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-*Cys-Trp… *表示有催化活性的半胱氨酸残基
44酶促化学修饰和酶活性调节 前述化学修饰是人工所为,本节介绍的是天然过程。 有些酶刚合成时是以酶原的形式存在,需要经过一个酶原激活过程:还有些酶需要经过共价 修饰才能激活。 44.1酶原的激活 44.1.1酶原 生物体内大多数酶当它们自发地(有些在分子伴侣的指导协助下)折叠成特定的三维结构时, 即获得了全部酶活力。也有一些酶刚合成出来是没有活性的前体,称为酶原。当酶原在特定的(体 内)位置被水解断裂一个和一些肽键,就成为了有活性的酶。如人的胃肠道中有许多蛋白酶,包 括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶等,它们在细胞内刚合成时,是酶 原形式,当分泌到胃肠道中后,受到胃肠道中蛋白酶的作用,肽键断裂,转变成活性酶。这样可 以避免这些酶对分泌器官的破坏。 44.1.2酶原激活的机制 表、一些蛋白酶的酶原及其性质 来源酶 用最酶原名称 激活因素 结果 胃蛋白酶 2胃蛋白酶原H或胃蛋白酶胃蛋白酶+6个多肽碎片 胃 凝乳酶 4尚未知 胰蛋白酶 7|胰蛋白酶原肠激酶或胰蛋胰蛋白酶+1个六肽 白酶中性pH 胰凝乳蛋白酶8胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶+2个二肽 胰 羧肽酶 7.5羧肽酶原胰蛋白酶 羧肽酶十几种碎片 弹性蛋白酶 弹性蛋白酶原胰蛋白酶 弹性蛋白酶+几种碎片 凝血酶 凝血酶原 凝血因子和Ca2凝血酶+肽段 血液|纤维蛋白溶酶7.5~纤维蛋白溶酶致活剂 纤维蛋白溶酶 8.6|原
8 4.4 酶促化学修饰和酶活性调节 前述化学修饰是人工所为，本节介绍的是天然过程。 有些酶刚合成时是以酶原的形式存在，需要经过一个酶原激活过程；还有些酶需要经过共价 修饰才能激活。 4.4.1 酶原的激活 4.4.1.1 酶原 生物体内大多数酶当它们自发地（有些在分子伴侣的指导协助下）折叠成特定的三维结构时， 即获得了全部酶活力。也有一些酶刚合成出来是没有活性的前体，称为酶原。当酶原在特定的（体 内）位置被水解断裂一个和一些肽键，就成为了有活性的酶。如人的胃肠道中有许多蛋白酶，包 括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶等，它们在细胞内刚合成时，是酶 原形式，当分泌到胃肠道中后，受到胃肠道中蛋白酶的作用，肽键断裂，转变成活性酶。这样可 以避免这些酶对分泌器官的破坏。 4.4.1.2 酶原激活的机制 表、一些蛋白酶的酶原及其性质 来源 酶 酶作 用最 适 pH 酶原名称 激 活 因 素 结 果 胃 胃蛋白酶 2 胃蛋白酶原 H ＋或胃蛋白酶 胃蛋白酶＋6 个多肽碎片 凝乳酶 4 尚未知 胰 胰蛋白酶 7 胰蛋白酶原 肠激酶或胰蛋 白酶 中性 pH 胰蛋白酶＋1 个六肽 胰凝乳蛋白酶 8 胰凝乳蛋白酶 原 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶＋2 个二肽 羧肽酶 7.5 羧肽酶原 胰蛋白酶 羧肽酶＋几种碎片 弹性蛋白酶 弹性蛋白酶原 胰蛋白酶 弹性蛋白酶＋几种碎片 血液 凝血酶 凝血酶原 凝血因子和 Ca2 凝血酶＋肽段 纤维蛋白溶酶 7.5 ~ 8.6 纤维蛋白溶酶 原 致活剂 纤维蛋白溶酶
其他组织组织蛋白酶A5尚未知 44.2共价修饰调节 共价修饰调节中最重要的也是最主要的是磷酸化脱磷酸化。 44_2.1通过磷酸化/脱磷酸而修饰调节的酶 表、一些可受磷酸化/脱磷酸调节的酶 以磷酸化形式为活性型的酶 以脱磷酸形式为活性型的酶 糖原磷酸化酶 糖原合成酶 糖原磷酸化酶b激酶 丙酮酸激酶(L型) 果糖-1,6-二磷酸酯酶(肝) 磷酸果糖激酶(2型) 胆固醇酯酶 丙酮酸脱氢酶 HMG COA还原酶激酶 HMG COA还原酶 激素敏感性脂肪酶乙酰CoA羧化酶(不同磷酸化位点作用不同) 乙酰CoA羧化酶 脂肪酸合成酶(不肯定) 苯丙氨酸羟化酶 支链α一酮酸脱氢酶 AMP磷酸二酯酶(受胰岛素激活) 44.2.2蛋白激酶 使蛋白质磷酸化的酶称为蛋白激酶( protein kinase,PK),PK已发现了很多种,一般分为 大类:①底物专一的蛋白激酶,如磷酸化酶激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等:②依赖于环核苷酸的蛋 白激酶,如cAMP依赖性蛋白激酶(A激酶)、cGMP依赖性蛋白激酶(G激酶):③其他蛋白激 酶,如组蛋白激酶等。PK所催化的反应如下 ATP蛋白激酶ADP 蛋白质 →蛋白质P F讠ˉ磷蛋白磷酸酶H20 A.A激酶 CAMP A激酶由两个催化亚基(C)和两个调节亚 基(R)组成,调节亚基实际上是催化亚基的抑(R)cm=|+ CAMP 制剂,当有cAMP存在时,cAMP与R亚基结活化的非活化的 无活性的游离态 调节亚基催化亚基 调节亚基 全酶(低活性 催化亚基 高活性
9 其他组织 组织蛋白酶 A 5 尚未知 4.4.2 共价修饰调节 共价修饰调节中最重要的也是最主要的是磷酸化/脱磷酸化。 4.4.2.1 通过磷酸化/脱磷酸而修饰调节的酶 表、一些可受磷酸化/脱磷酸调节的酶 以磷酸化形式为活性型的酶 以脱磷酸形式为活性型的酶 糖原磷酸化酶 糖原合成酶 糖原磷酸化酶 b 激酶 丙酮酸激酶（L 型） 果糖-1,6-二磷酸酯酶（肝） 磷酸果糖激酶（2 型） 胆固醇酯酶 丙酮酸脱氢酶 HMG CoA 还原酶激酶 HMG CoA 还原酶 激素敏感性脂肪酶 乙酰 CoA 羧化酶（不同磷酸化位点作用不同） 乙酰 CoA 羧化酶* 脂肪酸合成酶（不肯定） 苯丙氨酸羟化酶 支链α－酮酸脱氢酶 cAMP 磷酸二酯酶（受胰岛素激活） 4.4.2.2 蛋白激酶 使蛋白质磷酸化的酶称为蛋白激酶（protein kinase，PK），PK 已发现了很多种，一般分为三 大类：①底物专一的蛋白激酶，如磷酸化酶激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等；②依赖于环核苷酸的蛋 白激酶，如 cAMP 依赖性蛋白激酶（A 激酶）、cGMP 依赖性蛋白激酶（G 激酶）；③其他蛋白激 酶，如组蛋白激酶等。PK 所催化的反应如下： A．A 激酶 A 激酶由两个催化亚基（C）和两个调节亚 基（R）组成，调节亚基实际上是催化亚基的抑 制剂，当有 cAMP 存在时，cAMP 与 R 亚基结
合,使两个C亚基游离出来而激活 A激酶是体内最重要的蛋白激酶,它催化很多酶以及非酶蛋白的磷酸化反应 B.G激酶 G激酶由两个亚基组成,其激活方式与A激酶不同,2分子cGMP与酶结合后就形成活性形 式 E2+2 CGMP E2·2cGMP G激酶的反应速度仅为A激酶的百分之几,故在体内可能不起重要作用。但这两种蛋白激 酶在体内的分布不同,A激酶在胞浆多,G激酶在细胞核及质膜较多。 4.4.2.3磷酸化部位 般一个亚基上只有一个磷酸化部位,磷酸化部位大多是Sr的羟基,少数是Thr或Tr的 羟基 磷酸化的酶可被磷蛋白磷酸酶作用脱去磷酸。 共价修饰在酶活性的调节上(同时也在代谢途径的调节上)有重要的意义,如糖原降解(受 肾上腺素和胰高血糖素激活)和糖原合成(受胰岛素激活)。共价修饰调节酶活性有3个特点: ①快速;②耗能少;③有级联放大作用。 4.5酶的空间结构与功能的关系 45.1酶的二、三级结构与功能的关系 酶的二、三级结构靠二硫键( disulfide bonds, or bridge)、氢键( hydrogen bonds)、盐键(slt bonds)、疏水力( hydrophobic bonds)、范德华力( Van der Waals forces,取向力,诱导力,色散 力)等维持。( covalent bonds, noncovalent bonds)。蛋白质的一级结构决定其高级结构,即一级 结构包含了构成其高级结构的全部信息。然而,这个原则仅仅给出了蛋白质折叠的热力学可能性, 而折叠过程和折叠途径仍然是个谜。近年来,大量的实验及理论研究表明,生物体内蛋白质的准 确折叠和组装过程需要某些被称为分子伴侣( molecular chaperone)的辅助蛋白参与。分子伴侣 是进化上十分保守的一些蛋白质家族,广泛存在于各种生物体内,其主要作用是与新生肽或部分 折叠的蛋白质结合,加速其折叠或组装成天然构象的进程。分子伴侣的这种作用没有专一性,它 可以辅助许多蛋白质的折叠,它的主要作用方式是与没有折叠或部分折叠的蛋白质的疏水表面结 合,诱发正确的构象,并防止其相互聚集或错误折叠
10 合，使两个 C 亚基游离出来而激活。 A 激酶是体内最重要的蛋白激酶，它催化很多酶以及非酶蛋白的磷酸化反应。 B．G 激酶 G 激酶由两个亚基组成，其激活方式与 A 激酶不同，2 分子 cGMP 与酶结合后就形成活性形 式。 E2＋2 cGMP E2·2cGMP G 激酶的反应速度仅为 A 激酶的百分之几，故在体内可能不起重要作用。但这两种蛋白激 酶在体内的分布不同，A 激酶在胞浆多，G 激酶在细胞核及质膜较多。 4.4.2.3 磷酸化部位 一般一个亚基上只有一个磷酸化部位，磷酸化部位大多是 Ser 的羟基，少数是 Thr 或 Tyr 的 羟基。 磷酸化的酶可被磷蛋白磷酸酶作用脱去磷酸。 共价修饰在酶活性的调节上（同时也在代谢途径的调节上）有重要的意义，如糖原降解（受 肾上腺素和胰高血糖素激活）和糖原合成（受胰岛素激活）。共价修饰调节酶活性有 3 个特点： ①快速；②耗能少；③有级联放大作用。 4.5 酶的空间结构与功能的关系 4.5.1 酶的二、三级结构与功能的关系 酶的二、三级结构靠二硫键（disulfide bonds, or bridge）、氢键（hydrogen bonds）、盐键（salt bonds）、疏水力（hydrophobic bonds）、范德华力（Van der Waals forces，取向力，诱导力，色散 力）等维持。（covalent bonds，noncovalent bonds）。蛋白质的一级结构决定其高级结构，即一级 结构包含了构成其高级结构的全部信息。然而，这个原则仅仅给出了蛋白质折叠的热力学可能性， 而折叠过程和折叠途径仍然是个谜。近年来，大量的实验及理论研究表明，生物体内蛋白质的准 确折叠和组装过程需要某些被称为分子伴侣（molecular chaperone）的辅助蛋白参与。分子伴侣 是进化上十分保守的一些蛋白质家族，广泛存在于各种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分 折叠的蛋白质结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程。分子伴侣的这种作用没有专一性，它 可以辅助许多蛋白质的折叠，它的主要作用方式是与没有折叠或部分折叠的蛋白质的疏水表面结 合，诱发正确的构象，并防止其相互聚集或错误折叠