《酶学》课程教学资源（讲义）第三章酶活性的测定及分离纯化.doc_大学文库

1 第三章酶活性的测定及分离纯化在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即 u/ml 或 u/mg。 3.1.1 实用单位不同的酶采用不同的标准。如 DNA 聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30 分钟内催化 10nmol dNTP 合成为 TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如 T4 DNA 连接酶的单位定义为：在 20 μl 反应体积中，16℃，30 分钟内，将 50%的 HindⅢ酶切的λDNA 片段重新连接起来所需的酶量。ACC 合成酶的单位是：30℃，1 小时转化 SAM 生成 1nmol ACC 所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961 年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1 分钟转化 1μmol 底物，或转化 1μN 底物有关基团所需的酶量为 1 个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972 年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫 katal(kat)，katal 是一个很大的酶活单位，1 katal 是指 1 秒钟转化 1mol 底物，或转化 1N 底物有关基团所需的酶量。1 katal＝6×10u。 3.1.4 转换数在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在 1 分钟内转换底物成产物的μmol 数，可表示为： 1/Kp 称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为 u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越

2 高。但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2 酶活性测定的主要方法酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。因此，必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的 5%以内的速度为初速度的近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶浓度密切相关。 3.2.1 分光光度法（spectrophotometry）硝酸还原酶将 NO3－还原成 NO2－，NO2－与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在 520nm 处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以 NAD+或 NADP +为辅酶，NAD+或 NADP +在 340nm 处光吸收很少，而其还原形式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处光吸收较大，因此可以测定 340nm 处的光吸收变化来检测 NADH 和 NADPH 的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。 3.2.2 旋光测定法（polarimetry）若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。 3.2.3 荧光法（fluorescence）氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和 NADP +无荧光，而 NADH 和 NADPH 有 460nm 蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 3.2.4 同位素测定法（isotope determination）用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。 3.2.5 电化学方法（electrochemistry） 3.2.5.1 pH 测定

对于某些酶促反应过程中会产生H或减少H的反应来说,用、 1000DH单位的pH计测定反应液的pH变化,或为保持pH不变而加入酸或碱,记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.52电位测定在一些酶促氧化还原反应中,底物和产物具有不同的氧化还原电位,可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.53电流测定原理同上,以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.26化学反应法( chemical reaction) 酶促反应一段时间后,取出一部分反应液,用化学方法分析底物或产物的量。如ACC的测定:加HgCl2终止反应,加 NaOcI-NaOH混合液使ACC转化成乙烯,再用气相色谱测乙烯。 3.3酶的分离纯化 33.1酶分离纯化的一般原则酶的分离纯化是酶学研究的基础,对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋白质,所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性,利用它们的特殊性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究,必须获得适量的酶。首先要选择适当的材料,破碎细胞(酶存在于细胞外则不必破碎细胞)。若酶主要存在于某一细胞器中,应尽量分离出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性,每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度, 算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低,说明该步骤不合适。酶纯化般在低温条件下进行(0~4℃),但也有些酶有冷失活现象,如丙酮酸羧化酶在25℃下最稳定低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温,但只要其没有冷失活现象,也应在低温下操作,这样能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液(抽提液、萃取液、层析用液等)应该用缓冲液 pH应调到使酶最稳定的pH。若需要用到较酸或较碱的pH(如三氯乙酸沉淀),应尽量缩短时间有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间,尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂,常用的酶保护剂有巯基保护剂(巯基乙醇、谷胱甘肽GSH、二硫苏糖醇DII)、金属离子、EDIA、辅酶等,有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。用于酶纯化的方法主要有:分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等

3 对于某些酶促反应过程中会产生 H ＋或减少 H ＋的反应来说，用 1000 1 pH 单位的 pH 计测定反应液的 pH 变化，或为保持 pH 不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.5.2 电位测定在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.5.3 电流测定原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.2.6 化学反应法（chemical reaction）酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如 ACC 的测定：加 HgCl2终止反应，加 NaOCl-NaOH 混合液使 ACC 转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。 3.3 酶的分离纯化 3.3.1 酶分离纯化的一般原则酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性，利用它们的特殊性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。首先要选择适当的材料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度，算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃），但也有些酶有冷失活现象，如丙酮酸羧化酶在 25℃下最稳定，低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温，但只要其没有冷失活现象，也应在低温下操作，这样能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液（抽提液、萃取液、层析用液等）应该用缓冲液， pH 应调到使酶最稳定的 pH。若需要用到较酸或较碱的 pH（如三氯乙酸沉淀），应尽量缩短时间。有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间，尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂，常用的酶保护剂有巯基保护剂（巯基乙醇、谷胱甘肽 GSH、二硫苏糖醇 DTT）、金属离子、EDTA、辅酶等，有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。用于酶纯化的方法主要有：分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等

3.32材料的收集与处理 3.321原材料的选择生物体中酶含量一般很低,应选择含酶量髙的材料作为原料。选择适当的物种、器官、组织、细胞,甚至细胞器作为酶的来源,还应注意材料处于适当的发育阶段。必要时还可以采用人工处理(环境条件、试剂处理〕来提高酶的含量。材料来源应尽量方便、价廉,动物主要是选择器官和组织(如兔肌、牛心等),植物要选择器官和发育阶段(如黄化幼苗、绿叶等),微生物要选择菌株(还可以通过诱变来提高酶的含量)。要注意,不同来源的同一种酶,其结构和性质可能会有差异。 3322细胞的破碎动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆,研磨前可用低温预冷或液氮速冻。大量组织可用高速组织捣碎机。将组织制成丙酮粉,具有含水量低,脱脂,比较稳定等优点,往组织匀浆中加入-15~-20℃的冷丙酮,抽滤,再加几次丙酮并抽滤,沉淀部分在室温下放置1小时左右至无丙酮味,然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥,干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中保存备用。丙酮粉中的脂肪已被除去,可以避免脂质的干扰,并使原来不溶的酶(膜结合酶)溶于水。从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌,过滤或离心即可对于微生物细胞的破碎,可采用碱处理、溶菌酶加EDIA处理、渗透冲击、超声波破碎、固体剪切、液体剪切等方法。 3.323酶的抽提在破碎细胞时应加入抽提液。抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂(如苯甲磺酰氟PMSF) EDIA、巯基保护剂、甘油、Mg2等组成。若抽提的酶是膜结合酶,抽提液中还应含有非离子型的表面活性剂( Triton x-100、 Tween20、 Tween80等)。 333酶的初步纯化酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开,使目标酶的纯度提高。酶的纯度用比活性来衡量,以电泳结果为单带,且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。 3.33.1沉淀法 1.盐析法不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同,在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐,在不同

4 3.3.2 材料的收集与处理 3.3.2.1 原材料的选择生物体中酶含量一般很低，应选择含酶量高的材料作为原料。选择适当的物种、器官、组织、细胞，甚至细胞器作为酶的来源，还应注意材料处于适当的发育阶段。必要时还可以采用人工处理（环境条件、试剂处理）来提高酶的含量。材料来源应尽量方便、价廉，动物主要是选择器官和组织（如兔肌、牛心等），植物要选择器官和发育阶段（如黄化幼苗、绿叶等），微生物要选择菌株（还可以通过诱变来提高酶的含量）。要注意，不同来源的同一种酶，其结构和性质可能会有差异。 3.3.2.2 细胞的破碎动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆，研磨前可用低温预冷或液氮速冻。大量组织可用高速组织捣碎机。将组织制成丙酮粉，具有含水量低，脱脂，比较稳定等优点，往组织匀浆中加入－15～－20℃的冷丙酮，抽滤，再加几次丙酮并抽滤，沉淀部分在室温下放置 1 小时左右至无丙酮味，然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥，干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中保存备用。丙酮粉中的脂肪已被除去，可以避免脂质的干扰，并使原来不溶的酶（膜结合酶）溶于水。从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌，过滤或离心即可。对于微生物细胞的破碎，可采用碱处理、溶菌酶加 EDTA 处理、渗透冲击、超声波破碎、固体剪切、液体剪切等方法。 3.3.2.3 酶的抽提在破碎细胞时应加入抽提液。抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂（如苯甲磺酰氟 PMSF）、 EDTA、巯基保护剂、甘油、Mg 2＋等组成。若抽提的酶是膜结合酶，抽提液中还应含有非离子型的表面活性剂（Triton x-100、Tween 20、Tween 80 等）。 3.3.3 酶的初步纯化酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开，使目标酶的纯度提高。酶的纯度用比活性来衡量，以电泳结果为单带，且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。 3.3.3.1 沉淀法 1．盐析法不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同，在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐，在不同

5 的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来，离心可获得不同的蛋白质沉淀组分，这叫分级沉淀。常用的盐是硫酸铵，因为它在低温下溶解度高，对大多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。 2．有机溶剂沉淀常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮。不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下沉淀出来。 3．三氯乙酸沉淀尽快恢复到中性 pH。 4．PEG 沉淀聚乙二醇对蛋白质有保护作用，用 PEG 分级沉淀纯化效果很好。PEG2000、4000、6000、 8000 都可以用（平均分子量）。沉淀法要注意酶溶液的 pH、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。沉淀法还能起到浓缩的作用。对于耐热的酶还可以采用热变性的方法，高温下短时间处理，许多不耐热的蛋白质发生沉淀，离心后耐热的目标酶保留在上清液中。 3.3.3.2 透析与超滤 1．透析将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。在装有酶液的透析袋外加固体 Sephadex 或 PEG 吸水，可浓缩酶液。 2．超滤超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术，他是利用不同孔径的超滤膜，截留下不同分子量的蛋白质，从而使分子量不同的蛋白质分离开，从而达到浓缩和纯化的目的。超滤的方式有真空吸滤和离心超滤两种。蛋白质的超滤特性是可变的，这取决于许多因素。Westmacott（1972）研究了大肠杆菌部分纯化的青霉素酶制剂的超滤特性，他使用一种截留分子量 30,000 的各向异性膜，缓冲液的 pH 和盐浓度不同，酶的通透量变化在 1.6%到 55%之间；最高通透量在 pH5.1～6.2，接近酶的等电点；在 pH8.0 时，把缓冲液的浓度从 1mmol/L 提高到 30mmol/L，酶的通透量从 1.6%增加到 20%；加

EDTA也能提高酶的通透量,而尿素有相反的作用通过控制影响蛋白质超滤特性的因素,可使纯化倍数得到明显的提高,如经超滤可使大肠杆菌青霉素酶的纯度提高7倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质,如从酶液中去掉乙醇或脱盐,这种过程称为析滤。 334酶的进一步纯化 3.34l吸附层析羟基磷灰石( hydroxyapatite,HA)是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂,它是一种白色颗粒,分子式为Ca(PO4)6(OH2,它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完全清楚,一般认为HA的结晶表面外露的Ca和PO43参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋白质与HA上的Ca2+位点结合,高浓度的NaCl、KCl或CaCl2的存在既不影响两者的结合,也不影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用pH约68的低浓度磷酸缓冲液(20~120 mmol/L)。碱性蛋白质是结合在HA的PO43基团上,NaCl、KCl或CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。一般可用这些盐或浓度为120~230mmo/L的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓度很高的CaCl也洗不下来。总之,不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸缓冲液条件下上样,然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱,从而使各种蛋白质分离。HA柱的再生方法是:500mmo仉L磷酸钾缓冲液→100 mmol/L磷酸钾缓冲液→水→起始缓冲液平衡(起始缓冲液为5、10或20 mmol/L磷酸钾缓冲液)。 3342离子交换层析离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类,阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换基团,常见的阳离子交换基团有-SOH、-COOH、CH2COOH(CM)等;阴离子交换剂的衬质上带有阴离子交换基团,常见的阴离子交换基团有NH3C、二乙基胺乙基(DEAE)等。蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团,在一定的pH和离子强度下,这些基团可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换,使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和(或)离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下,不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同,分子大小也不同,它们与离子交换剂的结合力不同,结合力较弱的先洗脱下来,结合力较强的后洗脱下来,从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的pH,也可改变洗脱液的离子强度,或者二者同时改变

6 EDTA 也能提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。通过控制影响蛋白质超滤特性的因素，可使纯化倍数得到明显的提高，如经超滤可使大肠杆菌青霉素酶的纯度提高 7 倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质，如从酶液中去掉乙醇或脱盐，这种过程称为析滤。 3.3.4 酶的进一步纯化 3.3.4.1 吸附层析羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂，它是一种白色颗粒，分子式为 Ca10(PO4)6(OH)2，它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完全清楚，一般认为 HA 的结晶表面外露的 Ca 2+和 PO4 3－参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋白质与 HA 上的 Ca 2+位点结合，高浓度的 NaCl、KCl 或 CaCl2的存在既不影响两者的结合，也不影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用 pH 约 6.8 的低浓度磷酸缓冲液（20～120mmol/L）。碱性蛋白质是结合在 HA 的 PO4 3－基团上，NaCl、KCl 或 CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。一般可用这些盐或浓度为 120～230mmol/L 的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓度很高的 CaCl2也洗不下来。总之，不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸缓冲液条件下上样，然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱，从而使各种蛋白质分离。HA 柱的再生方法是：500mmol/L 磷酸钾缓冲液→100 mmol/L 磷酸钾缓冲液→水→起始缓冲液平衡（起始缓冲液为 5、10 或 20 mmol/L 磷酸钾缓冲液）。 3.3.4.2 离子交换层析离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类，阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换基团，常见的阳离子交换基团有-SO3H、-COOH、-CH2COOH（CM）等；阴离子交换剂的衬质上带有阴离子交换基团，常见的阴离子交换基团有-NH3＋Cl－、二乙基胺乙基（DEAE）等。蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的 pH 和离子强度下，这些基团可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变 pH 和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下，不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的 pH，也可改变洗脱液的离子强度，或者二者同时改变

在一般情况下,碱性蛋白质(等电点大于plH70)在pH小于等电点时带正电荷,被阳离子交换剂吸附;酸性蛋白质(等电点小于pH70)在pH大于等电点时带负电荷,被阴离子交换剂吸附离子交换剂的衬质(也称载体)常见的有树脂( resin)、纤维素( cellulose)、葡聚糖凝胶 ( Sephadex)、琼脂糖凝胶( Sepharose)、丙烯酸共聚物( Trisacryl)等。其中离子交换树脂物理性能稳定,蛋白质吸附容量高,装柱时沉降迅速,洗脱时允许高流速,但它的高吸附力用于蛋白质纯化时却往往是缺点,因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件,所以不常用于蛋白质的纯化。离子交换纤维素价格低廉,交换容量较低,一般为离子交换树脂交换容量的,,洗脱条件温和,是常用的离子交换剂。离子交换 Sephadex凝胶是在 Sephadex G-25或 Sephadex G-50上引入DEAE或CM基团制备成的。以 Sephadex G-50为衬质的离子交换凝胶具有高蛋白容量,但它们较软,而且在缓冲液pH或离子强度改变时会收缩或膨胀,不宜用于柱层析。把DEAE或CM基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换 Sepharose和 Trisacryl 这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的、能确保高流速的珠形颗粒组成,具有高蛋白容量。它们在一般层析压力下不变形,更重要的是它们在离子强度改变时及极端pH下都不会收缩或膨胀因此可在柱中再生。再生的方法是阳离子交换剂0.5NHCl→05 NAoH→0.5NHCl→水→平衡阴离子交换剂0.5 N NaOH→0.5NHCl→0.5 N NaOH→水→平衡 3.43凝胶过滤层析凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析。凝胶层析的原理可以用3-氯-1,2-环氧丙烷交联的 Sephadex凝胶来说明。所用的葡聚糖是由肠膜明串珠菌产生的产物,葡萄糖残基主要以 α-1,6-糖苷键联结。交联程度受所用的3-氯-1,2-环氧丙烷含量控制,从而决定了凝胶基质的水合 (复得水)程度及凝胶的孔隙度。每单位干重凝胶复得的水越多,其孔隙度也越大,它所能分级分离的分子也越大。葡聚糖/交联剂之比越大,孔隙度也越大,反之孔隙度小。若将一混合物上样到柱的上端,洗脱时,大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出,而小分子量的分子因能进入凝胶颗粒内部,延长了行进的路线而后流出。不能进入凝胶颗粒内部的最小分子的分子量称为该凝胶的排阻限度。在能进入凝胶颗粒内部的分子当中,分子量较大的先流出, 分子量较小的后流出,这样就能将不同分子量大小的物质分开。将洗脱液分部收集,找出酶活性

7 在一般情况下，碱性蛋白质（等电点大于 pH7.0）在 pH 小于等电点时带正电荷，被阳离子交换剂吸附；酸性蛋白质（等电点小于 pH7.0）在 pH 大于等电点时带负电荷，被阴离子交换剂吸附。离子交换剂的衬质（也称载体）常见的有树脂（resin）、纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、丙烯酸共聚物（Trisacryl）等。其中离子交换树脂物理性能稳定，蛋白质吸附容量高，装柱时沉降迅速，洗脱时允许高流速，但它的高吸附力用于蛋白质纯化时却往往是缺点，因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件，所以不常用于蛋白质的纯化。离子交换纤维素价格低廉，交换容量较低，一般为离子交换树脂交换容量的 10 1 ，洗脱条件温和，是常用的离子交换剂。离子交换 Sephadex 凝胶是在 Sephadex G-25 或 Sephadex G-50 上引入 DEAE 或 CM 基团制备成的。以 Sephadex G-50 为衬质的离子交换凝胶具有高蛋白容量，但它们较软，而且在缓冲液 pH 或离子强度改变时会收缩或膨胀，不宜用于柱层析。把 DEAE 或 CM 基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换 Sepharose 和 Trisacryl。这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的、能确保高流速的珠形颗粒组成，具有高蛋白容量。它们在一般层析压力下不变形，更重要的是它们在离子强度改变时及极端 pH 下都不会收缩或膨胀，因此可在柱中再生。再生的方法是：阳离子交换剂 0.5N HCl→0.5N NaOH→0.5N HCl→水→平衡阴离子交换剂 0.5N NaOH→0.5N HCl→0.5N NaOH→水→平衡 3.3.4.3 凝胶过滤层析凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析。凝胶层析的原理可以用 3-氯-1,2-环氧丙烷交联的 Sephadex 凝胶来说明。所用的葡聚糖是由肠膜明串珠菌产生的产物，葡萄糖残基主要以 α-1,6-糖苷键联结。交联程度受所用的 3-氯-1,2-环氧丙烷含量控制，从而决定了凝胶基质的水合（复得水）程度及凝胶的孔隙度。每单位干重凝胶复得的水越多，其孔隙度也越大，它所能分级分离的分子也越大。葡聚糖／交联剂之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。若将一混合物上样到柱的上端，洗脱时，大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出，而小分子量的分子因能进入凝胶颗粒内部，延长了行进的路线而后流出。不能进入凝胶颗粒内部的最小分子的分子量称为该凝胶的排阻限度。在能进入凝胶颗粒内部的分子当中，分子量较大的先流出，分子量较小的后流出，这样就能将不同分子量大小的物质分开。将洗脱液分部收集，找出酶活性

峰所在的管,即可得到纯化的酶。用洗脱液一直洗即可使柱再生。凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散分配的过程。分配系数Kav可简单地从以下公式得出:Kav=(ve-Voy(Vt-Vo),式中Ve=从柱上洗脱下溶质需溶剂的体积,V=外水体积,Ⅴt=柱床的总体积经验表明,Kav值与分子量的对数成反比。凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子外,还可用来测定蛋白质分子的分子量。先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其Kav值以分子量的对数为纵坐标,以Kav值(或简单地以洗脱体积)为横坐标,作出标准曲线,再测出未知分子量蛋白质的Kav值(或洗脱体积),在曲线上可查出其分子量的对数。 Sephadex有不同的型号,如 Sephadex G-100, Sephadex G25等。 Sephacryl是交联的烯丙基葡聚糖和N,N′一甲叉双丙烯酰胺共聚物,如 Sephacryl S-100,S-200,S-30,S-400S-500,.-1000 等,后面的数字越大则孔隙度越大。近年来,除了上述 Sephadex和 Sephacryl外,还有许多种材料用作凝胶层析的基质,如聚丙烯酰胺( Bio gel P系列)、琼脂糖( Sepharose2B,4B,6B和 Bio gelA系列)交联琼脂糖( Sepharose CL-2B,CL-4B,CL-6B)、聚苯乙烯、琼脂糖一聚丙烯酰胺混合物、多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲酯等。(同样是数字越大孔隙度越大)。一般来说,新产品的性能比老产品好 3.344疏水层析 Shaltiel等人在1972年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后可选择性地吸附某些酶。进一步的研究表明,这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间的疏水力作用的结果。酶分子的表面既有亲水性的基团或区域,也有非极性的疏水基团(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)或区域。疏水基团或区域可在酶分子的表面,也可处于亲水区域包围之中,形成疏水性的小孔或袋。在一定的条件下,琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用,使酶分子吸附到凝胶上。用能减弱疏水相互作用的洗脱液洗脱,就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。用尿素或乙醇、丁醇洗即可再生。目前常用的三种疏水层析介质是 Butyl- Sepharose CL4B、 Phenyl-Sepharose CL-4B和 Octyl- Sepharose CL-4B。三者中, Butyl-Sepharose CL-4B的疏水作用力最弱,octy- Sepharose CL-4B的疏水作用力最强。一般在不了解目标酶的疏水性能时,先试用疏水作用力较小的介质

8 峰所在的管，即可得到纯化的酶。用洗脱液一直洗即可使柱再生。凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散分配的过程。分配系数 Kav 可简单地从以下公式得出：Kav＝(Ve－Vo)/(Vt－Vo)，式中 Ve＝从柱上洗脱下溶质需溶剂的体积，Vo＝外水体积，Vt＝柱床的总体积。经验表明，Kav 值与分子量的对数成反比。凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子外，还可用来测定蛋白质分子的分子量。先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其 Kav 值，以分子量的对数为纵坐标，以 Kav 值（或简单地以洗脱体积）为横坐标，作出标准曲线，再测出未知分子量蛋白质的 Kav 值（或洗脱体积），在曲线上可查出其分子量的对数。 Sephadex 有不同的型号，如 Sephadex G-100，Sephadex G-25 等。Sephacryl 是交联的烯丙基葡聚糖和 N,N＇－甲叉双丙烯酰胺共聚物，如 Sephacryl S-100, S-200, S-300, S-400, S-500, S-1000 等，后面的数字越大则孔隙度越大。近年来，除了上述 Sephadex 和 Sephacryl 外，还有许多种材料用作凝胶层析的基质，如聚丙烯酰胺（Bio Gel P 系列）、琼脂糖（Sepharose 2B，4B，6B 和 Bio Gel A 系列）、交联琼脂糖（Sepharose CL-2B，CL-4B，CL-6B）、聚苯乙烯、琼脂糖—聚丙烯酰胺混合物、多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲酯等。（同样是数字越大孔隙度越大）。一般来说，新产品的性能比老产品好。 3.3.4.4 疏水层析： Shaltiel 等人在 1972 年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后，可选择性地吸附某些酶。进一步的研究表明，这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间的疏水力作用的结果。酶分子的表面既有亲水性的基团或区域，也有非极性的疏水基团(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)或区域。疏水基团或区域可在酶分子的表面，也可处于亲水区域包围之中，形成疏水性的小孔或袋。在一定的条件下，琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用，使酶分子吸附到凝胶上。用能减弱疏水相互作用的洗脱液洗脱，就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。用尿素或乙醇、丁醇洗即可再生。目前常用的三种疏水层析介质是 Butyl-Sepharose CL-4B 、 Phenyl-Sepharose CL-4B 和 Octyl-Sepharose CL-4B。三者中，Butyl-Sepharose CL-4B 的疏水作用力最弱，Octyl-Sepharose CL-4B 的疏水作用力最强。一般在不了解目标酶的疏水性能时，先试用疏水作用力较小的介质

疏水作用对于温度的影响是十分敏感的,温度高时疏水作用力增加,反之则减少。溶质的性质也可影响疏水作用力,引起盐析作用的物质如NaCl、NaSO等可增加疏水作用力,而引起盐溶作用的物质如盐酸胍、硫氰化钾、氯化四乙铵、尿素等则使疏水作用力减少。不同离子对疏水相互作用的影响见下表: 表2.1不同离子对疏水相互作用的影响盐析效应增强盐溶效应增强→ 阳离子NH,Rb,K+,Na,Cs+,L,Mg2 阴离子PO43-,SO42-,CH2COO,CI,Br,NO-,CO-,I,SCN 酶液在高盐浓度(如含有1~3mol/L(NH2SO4的缓冲液)时上样,然后用降低盐浓度的缓冲液、水或非极性溶剂如乙二醇等洗脱。疏水层析有三个优点:a.由于在高盐浓度时吸附, 硫酸铵沉淀后的样品不用脱盐可直接上样:b.洗脱条件温和,酶活回收率高;c.洗脱液盐浓度低,便于和后续纯化步骤相衔接 3345亲和层析 1.原理上述分离方法都是利用不同蛋白质分子的理化性质不同而将它们分离的,对每一种方法来说,都有若干种分子因其在该方面的理化性质相近而无法分开,但多种方法结合使用,可得到较纯的产品。亲和层析是利用蛋白质分子的生物特异性进行分离,因不同分子的生物特异性差别较大,所以分离效率高。酶与底物、酶与辅酶、酶与抑制剂、激素与受体、抗原与抗体之间都有特异的结合能力,将一方(称其为配基)偶联到载体上,即可特异性地与对应的另一方结合亲和层析的设计原理和过程可大致分为三步。一是选择合适的配基与不溶性的载体偶联,形成具有特异亲和性的分离介质;二是在适当的条件下,亲和介质选择性地吸附酶或其它生物活性分子,杂质与介质间没有亲和作用,故不能吸附而被洗涤去除;三是选择适当的条件使被吸附在亲和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱 2.载体(衬质) 载体应具有以下基本特性 a.与蛋白质的反应弱,以避免非专一性吸附。 b.偶联上配基后应具有良好的溶剂流速

9 疏水作用对于温度的影响是十分敏感的，温度高时疏水作用力增加，反之则减少。溶质的性质也可影响疏水作用力，引起盐析作用的物质如 NaCl、NaSO 等可增加疏水作用力，而引起盐溶作用的物质如盐酸胍、硫氰化钾、氯化四乙铵、尿素等则使疏水作用力减少。不同离子对疏水相互作用的影响见下表：表 2.1 不同离子对疏水相互作用的影响盐析效应增强 ← 盐溶效应增强 → 阳离子 NH ＋， Rb＋， K ＋， Na＋， Cs＋， L ＋， Mg 2＋， Ca 2＋， Ba 2＋阴离子 PO4 3－，SO4 2－，CH2COO －，Cl－，Br－，NO －，ClO －，I－，SCN －酶液在高盐浓度（如含有 1～3 mol／L (NH4)2 SO4的缓冲液）时上样，然后用降低盐浓度的缓冲液、水或非极性溶剂如乙二醇等洗脱。疏水层析有三个优点：a. 由于在高盐浓度时吸附，硫酸铵沉淀后的样品不用脱盐可直接上样；b. 洗脱条件温和，酶活回收率高；c. 洗脱液盐浓度低，便于和后续纯化步骤相衔接。 3.3.4.5 亲和层析： 1．原理上述分离方法都是利用不同蛋白质分子的理化性质不同而将它们分离的，对每一种方法来说，都有若干种分子因其在该方面的理化性质相近而无法分开，但多种方法结合使用，可得到较纯的产品。亲和层析是利用蛋白质分子的生物特异性进行分离，因不同分子的生物特异性差别较大，所以分离效率高。酶与底物、酶与辅酶、酶与抑制剂、激素与受体、抗原与抗体之间都有特异的结合能力，将一方（称其为配基）偶联到载体上，即可特异性地与对应的另一方结合。亲和层析的设计原理和过程可大致分为三步。一是选择合适的配基与不溶性的载体偶联，形成具有特异亲和性的分离介质；二是在适当的条件下，亲和介质选择性地吸附酶或其它生物活性分子，杂质与介质间没有亲和作用，故不能吸附而被洗涤去除；三是选择适当的条件使被吸附在亲和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱。 2．载体（衬质）载体应具有以下基本特性： a. 与蛋白质的反应弱，以避免非专一性吸附。 b. 偶联上配基后应具有良好的溶剂流速

c.含有可修饰的化学基团,偶联上配基后载体的结构不受破坏, d.可修饰的化学基团含量丰富,偶联后具有高吸附容量。 e.在偶联和洗脱的各种条件下,机械和化学性质稳定。 f.具有疏松的孔和亲水的网络结构,可使大分子自由通过,最好是球形、大小均匀、刚性的。珠粒状的琼脂糖凝胶( Sepharose)是在亲和层析中应用最广的载体。交联琼脂糖凝胶 ( Sepharose CL4B)较其母体有更佳的理化稳定性,若在使用时需要更为激烈的条件,可考虑选用交联琼脂糖凝胶作为载体。但是,交联会导致供偶联配基的位点减少,吸附容量也会相应减少 3.配基配基选择是否合适是关系到亲和层析成败的决定因素。可以作为配基的物质很多,可为较小的有机分子,也可为天然的生物活性分子。根据配基的性质,可将其分为两大类 a.特异配基( special ligand) 一般说来,酶和专一性抑制剂、抗原和抗体、激素和受体中的一方均为特异配基。以此类配基构成的亲和层析介质的选择特异性最高,分离效果也最好。缺点是此类配基多系不稳定的生物活性物质,在偶联时活性损失大,价格昂贵,成本高。 b.通用配基( general lig 以此类配基制备的亲和层析介质可用于一类物质的分离。如用NADH作配基可以吸附脱氢酶类,用ATP作配基可以吸附激酶类,用外源凝集素作配基可以吸附糖蛋白类。用通用配基制成的亲和层析介质的选择性低于用特异配基制成的亲和层析介质,但前者的应用范围较广,其中不少已有商品供应,故应用方便,价格也略较后者便宜。理想的配基在溶液中与酶结合后的解离常数应为103~10-4mol。当解离常数大于10 mol几L时亲和性太低,不能有效地吸附酶,如酶与某些弱抑制剂之间的亲和性即属此情况。反之当解离常数低于103mol几L时亲和性太强,导致洗脱十分困难,如激素与受体间的亲和性即属这种情况。另外,配基的结构中应有多个功能基团,以保证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位。 4.手臂用小分子配基直接偶联到载体上制备亲和层析介质时,尽管配基和酶之间的亲和力在适当的

10 c. 含有可修饰的化学基团，偶联上配基后载体的结构不受破坏。 d. 可修饰的化学基团含量丰富，偶联后具有高吸附容量。 e. 在偶联和洗脱的各种条件下，机械和化学性质稳定。 f. 具有疏松的孔和亲水的网络结构，可使大分子自由通过，最好是球形、大小均匀、刚性的。珠粒状的琼脂糖凝胶（Sepharose）是在亲和层析中应用最广的载体。交联琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B）较其母体有更佳的理化稳定性，若在使用时需要更为激烈的条件，可考虑选用交联琼脂糖凝胶作为载体。但是，交联会导致供偶联配基的位点减少，吸附容量也会相应减少。 3．配基配基选择是否合适是关系到亲和层析成败的决定因素。可以作为配基的物质很多，可为较小的有机分子，也可为天然的生物活性分子。根据配基的性质，可将其分为两大类： a. 特异配基（special ligand）一般说来，酶和专一性抑制剂、抗原和抗体、激素和受体中的一方均为特异配基。以此类配基构成的亲和层析介质的选择特异性最高，分离效果也最好。缺点是此类配基多系不稳定的生物活性物质，在偶联时活性损失大，价格昂贵，成本高。 b. 通用配基（general ligand）以此类配基制备的亲和层析介质可用于一类物质的分离。如用 NADH 作配基可以吸附脱氢酶类，用 ATP 作配基可以吸附激酶类，用外源凝集素作配基可以吸附糖蛋白类。用通用配基制成的亲和层析介质的选择性低于用特异配基制成的亲和层析介质，但前者的应用范围较广，其中不少已有商品供应，故应用方便，价格也略较后者便宜。理想的配基在溶液中与酶结合后的解离常数应为 10 -8 ～10 -4 mol /L。当解离常数大于 10 -4 mol /L 时亲和性太低，不能有效地吸附酶，如酶与某些弱抑制剂之间的亲和性即属此情况。反之，当解离常数低于 10 -8 mol /L 时亲和性太强，导致洗脱十分困难，如激素与受体间的亲和性即属这种情况。另外，配基的结构中应有多个功能基团，以保证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位。 4．手臂用小分子配基直接偶联到载体上制备亲和层析介质时，尽管配基和酶之间的亲和力在适当的

《酶学》课程教学资源（讲义）第三章 酶活性的测定及分离纯化

《酶学》课程教学资源（讲义）第三章酶活性的测定及分离纯化