第四章抗生素的生物合成途径 次级代谢的概念和 (一)概念 微生物在一定的生长时期(一般是稳定生长 期),以初级代谢产物为前体,合成一些对微 生物的生命活动没有明确功能的物质的过程就 是次级代谢,这一过程的产物即为次级代谢物 根据生理功能分为抗生素、色素、激素、生物 碱、毒素、酶抑制剂等
第四章 抗生素的生物合成途径 • 一、次级代谢的概念和特点 • （一）概念 • 微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长 期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微 生物的生命活动没有明确功能的物质的过程就 是次级代谢，这一过程的产物即为次级代谢物。 根据生理功能分为抗生素、色素、激素、生物 碱、毒素、酶抑制剂等
1.次级代谢以初级代谢产物为前体,并受初级代谢 的调节 链霉素 新花素 核酸毒 核背曲酸 新生笔素 艮它霉素 氯都素 例如糖降解产 卡那素 已糖酸一戊糖磷酸一丁糖磷酸 绿脓菌素 巴龙邵素 四环素 生的乙酰COA观 丙糖础酸 莽草酸 是合成四环素 核抛素 分支酸一酪氨 丝氨酸一骗酸甘油酸 红霉素及β 色氨酸苯丙氨酸新生富素 胡萝卜素的前 PEP 放线菌素支霉粘素林货都亲 霉素、/半胱氨酸 吲富素 体;缬氨酸、 头孢霉素}-振氨酸 丙酮酸 麦角酸 氨基己二酸 乙酰cDA 丙二散 半胱氨酸,是 耳酰乙酸 脂酸 合成青霉素、 四环素 顺乌头酸甲羟戊酸 Refo 红都淼 头孢霉素的前 a戊 麦角田醇 力福幂素 谷氨酸一二酸衣脉酸赤邵素 放线菌酮 体;色氨酸是 类胡萝卜素 曲张链蓝新 成麦角碱的 间型忿素 爾醇 类异戊二 前体等
• 二、次级代谢的特点 • 1. 次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢 的调节 例如糖降解产 生的乙酰CoA 是合成四环素 、红霉素及β- 胡萝卜素的前 体；缬氨酸、 半胱氨酸，是 合成青霉素、 头孢霉素的前 体；色氨酸是 合成麦角碱的 前体等
2.次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 此类微生物的生理过程可以区分为两个阶段 即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。例如, 链霉素、青霉素、金霉素、红霉素、杄菌肽等 都是在合成阶段形成。例如,青霉素合成中的 酰基转移酶、链霉素合成中的脒基转移酶等次 级代谢中的关键酶都在合成阶段被合成。一般 认为是由于碳分解产物产生阻遏作用的结果 阻遏解除后,合成阶段才能开始
• 2. 次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 • 此类微生物的生理过程可以区分为两个阶段， 即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。例如， 链霉素、青霉素、金霉素、红霉素、杆菌肽等， 都是在合成阶段形成。例如，青霉素合成中的 酰基转移酶、链霉素合成中的脒基转移酶等次 级代谢中的关键酶都在合成阶段被合成。一般 认为是由于碳分解产物产生阻遏作用的结果， 阻遏解除后，合成阶段才能开始
3.次级代谢酶的专一性低 一条途径中缺失某一个酶后,该酶反应前面的 物质并不积累,反应顺序后面的酶仍能起作用, 产生出一个分支代谢产物。例如金霉素链霉菌 S. aureofaciens)失去氯化能力或培养基中 没有氯化物存在时,不能合成金霉素。但用于 合成金霉素的中间产物,仍可进行氨基化、甲 基化反应,进而合成四环素
• 3. 次级代谢酶的专一性低 • 一条途径中缺失某一个酶后，该酶反应前面的 物质并不积累，反应顺序后面的酶仍能起作用， 产生出一个分支代谢产物。例如金霉素链霉菌 （S. aureofaciens）失去氯化能力或培养基中 没有氯化物存在时，不能合成金霉素。但用于 合成金霉素的中间产物，仍可进行氨基化、甲 基化反应，进而合成四环素
4.次级代谢产物合成酶是初级代谢物诱导产生的 初级代谢物可诱导合成酶的产生从而增加最终产物 的产量。在放线菌发酵过程起诱导作用的是由内源 代谢物如A因子。A因子既可诱导灰色链霉菌和比 基尼链霉菌( Streptomyces bikiniensis)的形态分 化,又诱导其化学分化.并且促进气生菌丝、分生 孢子、链霉素合成酶以及链霉素的形成。在灰色链 霉菌中,A因子能在转录水平上诱导至少10种蛋白 质,其中之一是链霉素_6磷酸转移酶,这种酶 具有两种功能:其一是参与链霉素的生物合成;其 是与抗性有关
• 4．次级代谢产物合成酶是初级代谢物诱导产生的 • 初级代谢物可诱导合成酶的产生从而增加最终产物 的产量。在放线菌发酵过程起诱导作用的是由内源 代谢物如A因子 。A因子既可诱导灰色链霉菌和比 基尼链霉菌（Streptomycs bikiniensis）的形态分 化，又诱导其化学分化．并且促进气生菌丝、分生 孢子、链霉素合成酶以及链霉素的形成。在灰色链 霉菌中，A因子能在转录水平上诱导至少10种蛋白 质，其中之一是链霉素—6—磷酸转移酶，这种酶 具有两种功能：其一是参与链霉素的生物合成；其 二是与抗性有关
5.次级代谢产物的合成不具有菌株特异性 产生菌的分类地位和其所产生的次级物质之间 没有相关性,分类地位相同的菌可以产生不同 的抗生素,分类地位不同的菌,可以产生相同 的抗生素。不过一种次级代谢产物只有相对较 少的几种微生物能够合成,并且一种微生物产 生的几种次级代谢产物通常是一组结构相关的 物质
• 5. 次级代谢产物的合成不具有菌株特异性 • 产生菌的分类地位和其所产生的次级物质之间 没有相关性，分类地位相同的菌可以产生不同 的抗生素，分类地位不同的菌，可以产生相同 的抗生素。不过一种次级代谢产物只有相对较 少的几种微生物能够合成，并且一种微生物产 生的几种次级代谢产物通常是一组结构相关的 物质
6.次级代谢与质粒的关系 吖啶黄插入质粒DNA双链碱基对之间,造成碱 基对增加或减少,高温则使质粒变性。它们使 原来产生抗生素的质粒不能复制,从而影响抗 生素的产生,说明了质粒控制着抗生素的合成。 从春日霉素和金丝霉素产生菌春日链霉菌的体 内分离出质粒,经电镜观察有三种不同长度 (15m、3.4ym和0.59m)的DNA。含有 15μmDNA的质粒控制春日霉素的合成;含有 34μmDNA的质粒,控制金丝霉素合成
• 6. 次级代谢与质粒的关系 • 吖啶黄插入质粒DNA双链碱基对之间，造成碱 基对增加或减少，高温则使质粒变性。它们使 原来产生抗生素的质粒不能复制，从而影响抗 生素的产生，说明了质粒控制着抗生素的合成。 • 从春日霉素和金丝霉素产生菌春日链霉菌的体 内分离出质粒，经电镜观察有三种不同长度 （15μm、3.4μm和0.59μm）的DNA。含有 15μmDNA的质粒控制春日霉素的合成；含有 3.4μm DNA的质粒，控制金丝霉素合成
抗生素生物合成的研究方法 与次级代谢产物的多样性不同,微生物生物合成次级 代谢产物的生化反应可以归纳为数目有限的若干条生 物合成途径。论证生物合成途径的一般步骤为:①确 定构成目的产物的构建单位即生源;②确定生物合成 途径中的关键的中间产物,合理地推断反应顺序;③ 分离鉴别生物合成反应中的关键酶。 由于生物合成过程中初级代谢和次级代谢两种途径相 互交叉,影响因素很多,因此生物合成机理的硏究较 为困难。常用的研究方法有以下几种
三、抗生素生物合成的研究方法 • 与次级代谢产物的多样性不同，微生物生物合成次级 代谢产物的生化反应可以归纳为数目有限的若干条生 物合成途径。论证生物合成途径的一般步骤为：①确 定构成目的产物的构建单位即生源；②确定生物合成 途径中的关键的中间产物，合理地推断反应顺序；③ 分离鉴别生物合成反应中的关键酶。 • 由于生物合成过程中初级代谢和次级代谢两种途径相 互交叉，影响因素很多，因此生物合成机理的研究较 为困难。常用的研究方法有以下几种：
畏养实验法在发酵的培养基中,加人某些可能 是前体的物质,观察该物质在发酵过程中的利用情况 与促进目的产物生成的效果 2)洗条菌丝是浮法或称静息细胞法( resting cell):取不同生长阶段的菌丝,先洗去沾染的原培 养基成分和代谢产物,然后将菌丝悬浮于人工培养系 统内,在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体 弋谢和对产物生物合成的影响。 ( block strains):将次级代谢产物 产生菌进行诱变处理,筛选出失去产生某种目的代谢 产物能力的突变株,即生物合成的阻断变株。这种阻 断变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物 通过分离、提纯、鉴别中间代谢产物,并与目的代谢 产物的化学结构相比较,推断出目的代谢产物的生物 合成的反应步骤,然后再分离其反应中的特殊酶类, 进一步判断其生化反应的特性
• （1）喂养实验法：在发酵的培养基中，加人某些可能 是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的利用情况 与促进目的产物生成的效果。 • （2）洗涤菌丝悬浮法或称静息细胞法（resting cells）：取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培 养基成分和代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系 统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体 代谢和对产物生物合成的影响。 • （3）阻断变株法（block strains）：将次级代谢产物 产生菌进行诱变处理，筛选出失去产生某种目的代谢 产物能力的突变株，即生物合成的阻断变株。这种阻 断变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物， 通过分离、提纯、鉴别中间代谢产物，并与目的代谢 产物的化学结构相比较，推断出目的代谢产物的生物 合成的反应步骤，然后再分离其反应中的特殊酶类， 进一步判断其生化反应的特性
4)亘补共合成法:应用两株生物合成阻断变株,当 它们单独培养时均不能产生目的代谢产物,而将它们 进行混合培养时获得目的产物或者以后某一步中间体。 通过分别提取、分离和鉴别阻断变株积累的中间体和 共合成的产物,了解它们的阻断部位和顺序以及反应 过程,推断目的产物的生物合成途径 :将具有放射性同位素3H或者14C标 记的可疑前体物质加人到次级代谢产物产生菌的培养 基中,培养结束后,提取分离目的代谢产物,测定结 合到次级代谢产物的同位素含量和分布情况,可以判 断试验化合物是否参与代谢产物的生物合成 :用适当的方法从细胞中分离纯化 制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加人到反应体系, 进行酶促反应。检测反应体系中的底物和产物浓度, 判断该酶是否催化目的产物的生物合成
• （4）互补共合成法：应用两株生物合成阻断变株，当 它们单独培养时均不能产生目的代谢产物，而将它们 进行混合培养时获得目的产物或者以后某一步中间体。 通过分别提取、分离和鉴别阻断变株积累的中间体和 共合成的产物，了解它们的阻断部位和顺序以及反应 过程，推断目的产物的生物合成途径。 • （5）同位素标记：将具有放射性同位素3H或者14C标 记的可疑前体物质加人到次级代谢产物产生菌的培养 基中，培养结束后，提取分离目的代谢产物，测定结 合到次级代谢产物的同位素含量和分布情况，可以判 断试验化合物是否参与代谢产物的生物合成。 • （6）无细胞抽提液：用适当的方法从细胞中分离纯化 制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加人到反应体系， 进行酶促反应。检测反应体系中的底物和产物浓度， 判断该酶是否催化目的产物的生物合成