5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 5.TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCI (pH8.0) 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 6.无水乙醇、异戊醇 7.70%乙醇 8.RNA酶 9.酚、氯仿、异戊醇等 四、实验内容与方法 1.用灭菌牙签或接种环挑取转化有质粒的单菌落于加有2mL相应抗 生素的LB液体培养基的试管中，37℃，150rpm振荡培养过夜。 2.取1.5ml的培养物转入到离心管中，4,000rpm离心2分钟收集菌 体。 3.吸去培养液，尽可能的去除培养液（否则容易降低质粒DNA的收量）。 4.加入100μL的溶液1，蜗旋振荡悬浮沉淀的菌体，室温放置10分 钟。 5.加入200μL的溶液Ⅱ（新鲜配置），盖紧离心管盖，上下颠倒混匀， 冰上放置5分钟，至菌液变清。 6.加入150μL溶液Ⅲ，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，冰上放置10 分钟。 7.12,000pm离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。 8.向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，反复混 匀后，12,000pm离心5分钟，将上清转移到新的离心管中。 9.向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀， 12,000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管中。 10.向上清液中加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀后室 温放置5~10分钟，12,000pm离心5分钟。倒去上清液，把离心管倒扣在 吸水纸上，吸干液体。 11.用1mL的70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，5,000rpm离心5分钟。 一般再重复一次。 12.将沉淀干燥（否则电泳点样时容易上飘，也不要太干燥，否则DNA 不容易溶解)。溶解于20μLTE(含有20μgmL的RNase)中，使DNA完 全溶解后，-20℃保存。 五、作业与思考10 5mol/L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 5. TE 缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 6. 无水乙醇、异戊醇 7. 70%乙醇 8. RNA 酶 9. 酚、氯仿、异戊醇等 四、 实验内容与方法 1. 用灭菌牙签或接种环挑取转化有质粒的单菌落于加有 2mL 相应抗 生素的 LB 液体培养基的试管中，37℃，150rpm 振荡培养过夜。 2. 取 1.5mL 的培养物转入到离心管中，4,000rpm 离心 2 分钟收集菌 体。 3. 吸去培养液，尽可能的去除培养液（否则容易降低质粒DNA的收量）。 4. 加入 100μL 的溶液Ⅰ，蜗旋振荡悬浮沉淀的菌体，室温放置 10 分 钟。 5. 加入 200μL 的溶液Ⅱ（新鲜配置），盖紧离心管盖，上下颠倒混匀， 冰上放置 5 分钟，至菌液变清。 6. 加入 150μL 溶液Ⅲ，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，冰上放置 10 分钟。 7. 12,000rpm 离心 10 分钟，将上清液转移至新的离心管中。 8. 向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），反复混 匀后，12,000rpm 离心 5 分钟，将上清转移到新的离心管中。 9. 向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀， 12,000rpm 离心 5 分钟，将上清转移到新的离心管中。 10. 向上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀后室 温放置 5~10 分钟，12,000rpm 离心 5 分钟。倒去上清液，把离心管倒扣在 吸水纸上，吸干液体。 11. 用 1mL 的 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，5,000rpm 离心 5 分钟。 一般再重复一次。 12. 将沉淀干燥（否则电泳点样时容易上飘，也不要太干燥，否则 DNA 不容易溶解）。溶解于 20μLTE（含有 20μg/mL 的 RNase）中，使 DNA 完 全溶解后，-20 ℃保存。 五、 作业与思考