实验四质粒DNA的提取 一、目的要求 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的方法。 二、实验原理 质粒是独立于染色体外能进行自主复制的双链环状的DNA,大小在 1~200kb之间。质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（抗氨苄青霉素、抗四 环素等)，因而被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性。 从宿主中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能。分 离质粒DNA有三个步骤：1.培养细菌使质粒扩增。2.收集和裂解细菌。 3.分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法有很多，目 前常用的有碱裂解法，煮沸法，SDS法和羟基磷灰石层析法等。 本次实验用的是碱裂解法。其优点是得率高，适合于大多数的菌株，所 得的产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。碱变性提取质粒DNA是 依据染色体DNA与质粒的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH介 于12.0-12.5这个狭窄的范围内（变性液），线性的染色体DNA的氢键断裂， 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下质粒DNA的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，仍然缠绕在一起 不分开：当以pH48的乙酸钾高盐缓冲液（中和液）恢复pH至中性时，共 价闭合的环状质粒DNA的两条互补链恢复原来的构型，即双链结构，而保 存在溶液中。而染色体不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，大部分 的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质一一SDS复合物等细胞碎 片缠绕在一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清液中。可以通过酚 氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三、 实验用品 (一)仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机 (二)试剂 1.LB液体培养基 2.溶液I: 50mmol/L 葡萄糖 25mmo1/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HC1(pH8.0) 10mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) 3.溶液Ⅱ 0.4mo1/LNa0H,2%SDS,用时等体积混合，现用现配 4.溶液Ⅲ 9 实验四 质粒 DNA 的提取 一、 目的要求 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的方法。 二、 实验原理 质粒是独立于染色体外能进行自主复制的双链环状的 DNA，大小在 1~200kb 之间。质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（抗氨苄青霉素、抗四 环素等），因而被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性。 从宿主中提取质粒 DNA，是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。分 离质粒 DNA 有三个步骤：1. 培养细菌使质粒扩增。2. 收集和裂解细菌。 3. 分离和纯化质粒 DNA。从大肠杆菌中分离质粒 DNA 的方法有很多，目 前常用的有碱裂解法，煮沸法，SDS 法和羟基磷灰石层析法等。 本次实验用的是碱裂解法。其优点是得率高，适合于大多数的菌株，所 得的产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。碱变性提取质粒 DNA 是 依据染色体 DNA 与质粒的变性与复性的差异而达到分离的目的。在 pH 介 于 12.0~12.5 这个狭窄的范围内（变性液），线性的染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下质粒 DNA 的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，仍然缠绕在一起 不分开；当以 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液（中和液）恢复 pH 至中性时，共 价闭合的环状质粒 DNA 的两条互补链恢复原来的构型，即双链结构，而保 存在溶液中。而染色体不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，大部分 的染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质——SDS 复合物等细胞碎 片缠绕在一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA 留在上清液中。可以通过酚、 氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。 三、 实验用品 （一） 仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机。 （二） 试剂 1. LB 液体培养基 2. 溶液Ⅰ： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris） Tris-HCl(pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）(pH8.0) 3. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH,2% SDS,用时等体积混合，现用现配。 4. 溶液Ⅲ