CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶(20~40μm) 按键合到基质上的官能团可分为: (1)反相柱:填料是非极性的,官能团为烷烃,例如:Cl8(ODS)、C8、C4等 (2)正相柱:填料是极性的,官能团为一CN氰基、一NH2氨基等 (3)离子交换键合相 阳离子官能团:-SO3H磺酸基、一COOH羧基等。 阴离子官能团:一R4N*季铵基、-氨基等 (由于硅胶基质的键合相只能在pl=2~75的范围内使用,而离子交换色谱要求 有更宽的pH范围,因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相: 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下: H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成是:“甲醇一H2O”和“乙腈一H2O”,由于乙腈的剧毒性,通常 优先考虑“甲醇一H2O”流动相 反相色谱中,溶质按其疏水性大小进行分离,极性越大疏水性越小的溶质,越不易与 非极性的固定相结合,所以先被洗脱下来。流动相的p对样品溶质的电离状态影响很大, 进而影响其疏水性,所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中,经常要加入修饰性 的离子对物质,最常用的离子对试剂是三氟乙酸(TFA),使用浓度为0.1%,使流动相的 pH值为2~3,这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介,使其疏水性增加,延长洗脱 时间,提高分辨率和分离效果 完全离子化的溶质,例如强酸或强碱,其在反相键合相上的保留值很低,近于死时间 流出,不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷(A+)相反的离子 (B-),称为对离子,加入到流动相中,使其与样品离子结合生成弱极性的离子对,即中 性缔合物,从而增强了样品的疏水性,加大了保留值,改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇 其中最常用的是正已烷,虽然其价格较贵,但80%的顺、反和邻位、对位异构体仍 然要用正相色谱来进行分离 流动相的选择原则是:①样品易溶,且溶解度尽可能大。②化学性质稳定,不损坏柱 子。③不妨碍检测器检测,紫外波长处无吸收。④粘度低,流动性好。⑤易于从其中回收 样品。⑥无毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高纯度,即色谱纯。⑧废液易处理,不污染 环境。 142142 CH、C3、C4 等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4 等。 ⑵正相柱：填料是极性的，官能团为 －CN 氰基、－NH2 氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H 磺酸基、－COOH 羧基等。 阴离子官能团：―R4N ＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在 pH＝2～7.5 的范围内使用，而离子交换色谱要求 有更宽的 pH 范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相： 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常 优先考虑“甲醇—H2O”流动相。 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与 非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的 pH 对样品溶质的电离状态影响很大， 进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性 的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为 0.1％，使流动相的 pH 值为 2～3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱 时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间 流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A ＋）相反的离子 （B －），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中 性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但 80％的顺、反和邻位、对位异构体仍 然要用正相色谱来进行分离。 流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱 子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收 样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染 环境