Animal Husbandry Veterinary Medicine 2020 Vol. 52 No. 2 场,卵巢离体后立刻放入液氮中保存,转移至实验室 TRIzol加入0.6mL异丙醇,混匀放置5~10min,4 后置于液氮罐中待用。 ℃12000r/min离心15min。每毫升 trizol加入1 PremiⅸxTq酶、DL2000 DNA marker、反转录试mL75%乙醇,温和震荡使沉淀悬浮,4℃7500r 剂盒、pMDl8-T载体、T4连接酶、DH5α感受态大min离心5min。弃去酒精,所得沉淀室温干燥5~10 肠杆菌购自 TaKara公司,DNA纯化回收试剂盒、质min后用60℃DEPC处理纯净水溶解,紫外分光光 粒小提试剂盒购自天根公司,TRol试剂、氯仿、无度计检测浓度及质量。 水乙醇等试剂购自天地扬公司。 依照反转录试剂盒操作说明操作反转录cDNA。 1.2方法 所得cDNA溶液置于-20℃保存。 1.2.1水牛卵巢组织RNA提取及反转录 1.2.2引物设计与合成 将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵,加入液氮反 参考NCBI数据库( Gene id:102413682,NW 复、充分研磨。每50~100mg组织加入1 mL TRIzol,005785813)中预测的水牛CART基因mRNA序列 再用电动匀浆器充分匀浆1~2min,12000r/min离使用NCBI在线引物设计软件设计引物扩增其CDS区 心5min,弃沉淀,每毫升 trizol加入200μ氯仿,序列,引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成 手动混匀15s,室温放置10min。4℃1200r/min引物信息见表1。 离心15min,取上层水相转移至新的离心管,每毫升 表1水牛CART基因扩增引物序列 引物名称 引物序列(5′→3′) 退火温度/℃ 扩增产物长度/bp F. GCCTACAGACGGTTGACCC CART-CDS 573 R. TIGCTAAAGCCAGACTCCAGG 1.2.3PCR扩增及载体构建 SwisS-modEl(htTp: //swiss-model. expasy. org/)1es PCR反应体系25μL: Premix Taq12.5μL,软件分析蛋白质理化性质、二级和三级结构,利用 dH2O9.5μ,100ng/μ L CDNA模板1μL,10 ng/ PSORT II prediction在线软件(hts:// psort.hge.jn μL上下游引物各1μL,dH2O15.75μL。PCR反应fom2htm)预测CART蛋白的亚细胞定位, STRING 条件:98℃预变性3min;98℃变性30s,62℃退蛋白质互作数据库检索水牛CART蛋白质序列,在 火30s.72℃延伸90s,共35个循环;72℃延伸6http://kiharalab.org/web/results.phpjob_id=49337 min,4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检网站上进行蛋白质功能预测。 测,用DNA纯化回收试剂盒切胶回收。将回收的 PCR产物与pMD18-T载体通过T4连接酶过夜连接, 2结果与分析 转化感受态大肠杆菌DH5α,37℃、100r/min培养12.1水牛CART基因的PCR扩增 h,涂于含有Amp、X-gl、IPTG的IB固体培养基 紫外分光光度计检测所得RNA纯度及浓度较好。 上,37℃培养12h后挑取阳性单克隆扩增培养。用以反转录所得ωDNA为模板,用所设计引物扩增结果 质粒小提试剂盒提取质粒后PCR检测鉴定,将检测如图1所示。由图可见,所设计引物PCR扩增产物 阳性的质粒送北京奧科鼎盛生物科技有限公司测序条带清晰且特异性良好,与预期大小相符,可进行下 鉴定 步试验。 1.2.4生物信息学分析 2.2水牛CART基因克隆及测序 CART基因序列比对及同源性使用NCBI在线分 扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌,经挑选培养 析,使用MEGA7.0软件构建系统进化树。通过在线后送测序鉴定。菌液PCR产物约570bp大小(图2) 软件 TMHMM2.0(htp:/w.chs.du.dk/ services/为阳性克隆,将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。 TMHMM/)预测分析跨膜结构及信号肽,使用Prot测序结果与NCBI序列对比显示扩增获得序列与 param(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/pot-CART基因CDS区域一致,与预期相同(图3、图 param)、 Prot scale(htts://web. expasy.og/mp/4)。所获得的水牛CART基因CDS序列全长为351 scores55205.txt)、 SOPMA(htp://npsa- pbil. ibep.f/bp,编码116个氨基酸。 cgi-bin/npsa_automat. pl? page= npsa_sopma. html)场， 卵巢离体后立刻放入液氮中保存， 转移至实验室 后置于液氮罐中待用。 Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ 酶、 ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、 反转录试 剂盒、 ｐＭＤ１８－Ｔ 载体、 Ｔ４ 连接酶、 ＤＨ５α 感受态大 肠杆菌购自 ＴａＫａＲａ 公司， ＤＮＡ 纯化回收试剂盒、 质 粒小提试剂盒购自天根公司， ＴＲＩｚｏｌ 试剂、 氯仿、 无 水乙醇等试剂购自天地扬公司。 １􀆰 ２ 方法 １􀆰 ２􀆰 １ 水牛卵巢组织 ＲＮＡ 提取及反转录 将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵， 加入液氮反 复、 充分研磨。 每 ５０～１００ ｍｇ 组织加入 １ ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ， 再用电动匀浆器充分匀浆 １ ～ ２ ｍｉｎ， １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ， 弃沉淀， 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 ２００ μＬ 氯仿， 手动混匀 １５ ｓ， 室温放置 １０ ｍｉｎ。 ４ ℃ １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ， 取上层水相转移至新的离心管， 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 ０􀆰 ６ ｍＬ 异丙醇， 混匀放置 ５ ～ １０ ｍｉｎ， ４ ℃ １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ。 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 １ ｍＬ ７５％乙醇， 温和震荡使沉淀悬浮， ４ ℃ ７ ５００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ。 弃去酒精， 所得沉淀室温干燥 ５ ～ １０ ｍｉｎ 后用 ６０ ℃ ＤＥＰＣ 处理纯净水溶解， 紫外分光光 度计检测浓度及质量。 依照反转录试剂盒操作说明操作反转录 ｃＤＮＡ。 所得 ｃＤＮＡ 溶液置于－２０ ℃保存。 １􀆰 ２􀆰 ２ 引物设计与合成 参考 ＮＣＢＩ 数据库 （ Ｇｅｎｅ ＩＤ： １０２４１３６８２， ＮＷ ＿ ００５７８５８１３） 中预测的水牛 ＣＡＲＴ 基因 ｍＲＮＡ 序列， 使用 ＮＣＢＩ 在线引物设计软件设计引物扩增其 ＣＤＳ 区 序列， 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。 引物信息见表 １。 表 １ 水牛 ＣＡＲＴ 基因扩增引物序列 引物名称 引物序列 （５′ →３′ ） 退火温度／ ℃ 扩增产物长度／ ｂｐ ＣＡＲＴ－ＣＤＳ Ｆ： ＧＣＣＴＡＣＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＣＣＣ Ｒ： ＴＴＧＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧ ６０ ５７３ １􀆰 ２􀆰 ３ ＰＣＲ 扩增及载体构建 ＰＣＲ 反 应 体 系 ２５ μＬ： Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ １２􀆰 ５ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ ９􀆰 ５ μＬ， １００ ｎｇ ／ μＬ ｃＤＮＡ 模板 １ μＬ， １０ ｎｇ ／ μＬ 上下游引物各 １ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ １５􀆰 ７５ μＬ。 ＰＣＲ 反应 条件： ９８ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎ； ９８ ℃ 变性 ３０ ｓ， ６２ ℃ 退 火 ３０ ｓ， ７２ ℃延伸 ９０ ｓ， 共 ３５ 个循环； ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎ， ４ ℃ 保存。 ＰＣＲ 产物用 ２％琼脂糖凝胶电泳检 测， 用 ＤＮＡ 纯化回收试剂盒切胶回收。 将回收的 ＰＣＲ 产物与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载体通过 Ｔ４ 连接酶过夜连接， 转化感受态大肠杆菌 ＤＨ５α， ３７ ℃ 、 １００ ｒ／ ｍｉｎ 培养 １ ｈ， 涂于含有 Ａｍｐ、 Ｘ－ｇａｌ、 ＩＰＴＧ 的 ＬＢ 固体培养基 上， ３７ ℃培养 １２ ｈ 后挑取阳性单克隆扩增培养。 用 质粒小提试剂盒提取质粒后 ＰＣＲ 检测鉴定， 将检测 阳性的质粒送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序 鉴定。 １􀆰 ２􀆰 ４ 生物信息学分析 ＣＡＲＴ 基因序列比对及同源性使用 ＮＣＢＩ 在线分 析， 使用 ＭＥＧＡ ７􀆰 ０ 软件构建系统进化树。 通过在线 软件 ＴＭＨＭＭ ２􀆰 ０ （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｃｂｓ． ｄｔｕ． ｄｋ ／ ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ ＴＭＨＭＭ／ ）预测分析跨膜结构及信号肽， 使用 Ｐｒｏｔ ｐａｒａｍ（ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ ／ ｃｇｉ－ｂｉｎ ／ ｐｒｏｔｐａｒａｍ ／ ｐｒｏｔ⁃ ｐａｒａｍ ）、 Ｐｒｏｔ ｓｃａｌｅ （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｗｅｂ． ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ ／ ｔｍｐ ／ ｓｃｏｒｅｓ１５５２０５􀆰 ｔｘｔ）、ＳＯＰＭＡ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｎｐｓａ － ｐｂｉｌ． ｉｂｃｐ． ｆｒ／ ｃｇｉ－ ｂｉｎ ／ ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ． ｐｌ？ ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ ＿ ｓｏｐｍａ． ｈｔｍｌ）、 ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ． ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ ／ ）在线 软件分析蛋白质理化性质、 二级和三级结构， 利用 ＰＳＯＲＴ ＩＩ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 在线软件 （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｐｓｏｒｔ． ｈｇｃ． ｊｐ ／ ｆｏｒｍ２􀆰 ｈｔｍｌ）预测 ＣＡＲＴ 蛋白的亚细胞定位， ＳＴＲＩＮＧ 蛋白质互作数据库检索水牛 ＣＡＲＴ 蛋白质序列， 在 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｋｉｈａｒａｌａｂ． ｏｒｇ ／ ｗｅｂ ／ ｒｅｓｕｌｔｓ． ｐｈｐ？ ｊｏｂ ＿ ｉｄ ＝ ４９３３７ 网站上进行蛋白质功能预测。 ２ 结果与分析 ２􀆰 １ 水牛 ＣＡＲＴ 基因的 ＰＣＲ 扩增 紫外分光光度计检测所得 ＲＮＡ 纯度及浓度较好。 以反转录所得 ｃＤＮＡ 为模板， 用所设计引物扩增结果 如图 １ 所示。 由图可见， 所设计引物 ＰＣＲ 扩增产物 条带清晰且特异性良好， 与预期大小相符， 可进行下 一步试验。 ２􀆰 ２ 水牛 ＣＡＲＴ 基因克隆及测序 扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌， 经挑选培养 后送测序鉴定。 菌液 ＰＣＲ 产物约 ５７０ ｂｐ 大小 （图 ２） 为阳性克隆， 将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。 测序结果与 ＮＣＢＩ 序列对比显示扩增获得序列与 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 区域一致， 与预期相同 （图 ３、 图 ４）。 所获得的水牛 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 序列全长为 ３５１ ｂｐ， 编码 １１６ 个氨基酸。 ·２· Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０ Ｖｏｌ􀆰 ５２ Ｎｏ􀆰 ２