《畜牧与兽医》：水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测（2020年）.pdf_大学文库

畜牧与兽医2020年第52卷第2期于农淇,鄢胜飞,覃广胜,等.水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测[J].畜牧与兽医,2020,52(2):1-6 YU N Q, YAN S F, QIN G S, et al. Cloning, sequencing and bioinformatics analysis of the CART gene in buffalo [J. Animal Husbandry Veterinary Medi- cine,2020,52(2):1-6. 水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测于农淇,鄢胜飞,覃广胜,尚江华,郑海英,杨春艳 (中国农业科学院广西水牛研究所/广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001) 摘要:为探讨水牛可卡因-苯丙胺调节转录肽( cocaine- and amphetamine-regulated transcript,CART)基因功能,以水牛卵巢组织RNA转录的 cDNA为模板,参考 GenBank预测的水牛CART基因组序列设计引物,采用PCR和在线生信分析软件对CART基因进行克隆和蛋白质结构预测分析。结果显示:水牛CART基因CDs区全序列长为351bp,编码116个氨基酸;对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示,水牛CART基因与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼、单峰驼、野猪、马、非洲野驴、人类及猕猴相似程度分别为100%、%8%、100%、98%、91%、9%」 78%、85%、85%、81%、90%;Me分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性;蛋白质结构预测显示,CART蛋白含有N端信号肽,是分泌蛋白,功能与神经、辅酶和离子结合相关。关键词:CART;水牛;蛋白质功能预测中图分类号:S823.83 文献标志码:A文章编号:0529-5130(2020)02-0001-06 Cloning, sequencing and bioinformatics analysis of the cart gene in buffalo YU Nongqi, YAN Shengfei, QIN Guangsheng, SHANG Jianghua, ZHENG Haiying, YANG Chunyan Guangxi Key Laboratory of Buffalo Genetics, Breeding and Reproduction/Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, China) Abstract: In this study, the cocaine-and amphetamine-regulated transcript( CART) gene of buffalos was cloned and its protein structure was predicted. The cDNA transcribed by RNA was extracted from the ovaries of buffalos as templates, primers were designed according to the genomic sequence of CARt predicted by GenBank so as to amplify and sequence the CDS region of the Cart gene of theanimals. The results showed that the total length of the CDS region of the buffalo CART gene was 351 bp, encoding 116 amino acids. The analysis of nucleic acid sequence and protein structure indicated that the similarities between the buffalo Cart gene and that of American bison, wild yak, common cattle, sheep, bactrian camel and single hump camel, wild boar, horse and African wild donkey, human and macaque were 100%, 98% 100%6,98%,91%,91%, 78%,85%,85%,81% and 90%, respectively. The prediction of protein structure indicated that the CArT pro- tein contained N-terminal signal peptides confirming it to be a secretory protein. The present study laid a foundation for further research on the function of the Cart gene in buffalos Keywords: CART; buffalo; protein function prediction 可卡因-苯丙胺调节转录肽( cocaine- and an关2-4。水牛CART基因( Gene id:102413682,NW phetamine- regulated transcript,CART)广泛分布于中005785813)全长为2059bp,有3个CDS区,mRNA 枢神经系统和外周神经系统,被认为是参与食物摄入全长775b,CDS全长312bp。前人对水牛CART及调控的主要无食欲肽。CART是一种关键的神经递其基因的研究不多,尤其缺少奶水牛上该基因结构、质和激素,参与调节多种生物过程,包括食物摄入、表达蛋白分析的相关研究。本研究通过克隆奶水牛维持体重、奖励和成瘾、应激反应、心理刺激效应和CART基因CDS区序列,分析研究其编码蛋白质的氨内分泌功能,并被报道与家畜繁殖力、生产性能有基酸结构及蛋白定位、互作,丰富了CART基因数据信息,为今后CART对水牛内分泌和生长繁殖作用的收稿日期:2019-03-21;修回日期:2019-12-16 研究提供数据支撑。基因项目:广西科技计划项目(桂科AB16380040);广西水牛研所基本科研业务费项目(水牛基180503) 1材料与方法第一作者:于农淇(1991-):女,壮族,硕士令·通信作者:杨春艳,副研究员,研究方向为动物遗传育种与繁1.1材料 E-mail:86748227(@qg.como 试验所用水牛卵巢组织样本来自广西南宁屠宰

于农淇，鄢胜飞，覃广胜，等．水牛ＣＡＲＴ基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测［Ｊ］．畜牧与兽医，２０２０，５２（２）：１－６．ＹＵＮＱ，ＹＡＮＳＦ，ＱＩＮＧＳ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＣＡＲＴｇｅｎｅｉｎｂｕｆｆａｌｏ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉ⁃ ｃｉｎｅ，２０２０，５２（２）：１－６．水牛ＣＡＲＴ基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测于农淇，鄢胜飞，覃广胜，尚江华，郑海英，杨春艳∗ （中国农业科学院广西水牛研究所／广西水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁５３０００１）摘要：为探讨水牛可卡因－苯丙胺调节转录肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ＣＡＲＴ）基因功能，以水牛卵巢组织ＲＮＡ转录的ｃＤＮＡ为模板，参考ＧｅｎＢａｎｋ预测的水牛ＣＡＲＴ基因组序列设计引物，采用ＰＣＲ和在线生信分析软件对ＣＡＲＴ基因进行克隆和蛋白质结构预测分析。结果显示：水牛ＣＡＲＴ基因ＣＤＳ区全序列长为３５１ｂｐ，编码１１６个氨基酸；对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示，水牛ＣＡＲＴ基因与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼、单峰驼、野猪、马、非洲野驴、人类及猕猴相似程度分别为１００％、９８％、１００％、９８％、９１％、９１％、７８％、８５％、８５％、８１％、９０％；Ｍｅｇａ分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性；蛋白质结构预测显示，ＣＡＲＴ蛋白含有Ｎ端信号肽，是分泌蛋白，功能与神经、辅酶和离子结合相关。关键词：ＣＡＲＴ；水牛；蛋白质功能预测中图分类号：Ｓ８２３􀆰 ８３文献标志码：Ａ文章编号：０５２９－５１３０（２０２０）０２－０００１－０６Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＣＡＲＴｇｅｎｅｉｎｂｕｆｆａｌｏＹＵＮｏｎｇｑｉ，ＹＡＮＳｈｅｎｇｆｅｉ，ＱＩＮＧｕａｎｇｓｈｅｎｇ，ＳＨＡＮＧＪｉａｎｇｈｕａ，ＺＨＥＮＧＨａｉｙｉｎｇ，ＹＡＮＧＣｈｕｎｙａｎ ∗ （ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｕｆｆａｌｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／ＢｕｆｆａｌｏＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）ｇｅｎｅｏｆｂｕｆｆａｌｏｓｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｉｔｓｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．ＴｈｅｃＤＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｂｙＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｏｖａｒｉｅｓｏｆｂｕｆｆａｌｏｓａｓｔｅｍｐｌａｔｅｓ，ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＡＲＴｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙＧｅｎＢａｎｋｓｏａｓｔｏａｍｐｌｉｆｙａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅＣＤＳｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＣＡＲＴｇｅｎｅｏｆｔｈｅａｎｉｍａｌｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅＣＤＳｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｕｆｆａｌｏＣＡＲＴｇｅｎｅｗａｓ３５１ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ１１６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｂｕｆｆａｌｏＣＡＲＴｇｅｎｅａｎｄｔｈａｔｏｆＡｍｅｒｉｃａｎｂｉｓｏｎ，ｗｉｌｄｙａｋ，ｃｏｍｍｏｎｃａｔｔｌｅ，ｓｈｅｅｐ，ｂａｃｔｒｉａｎｃａｍｅｌａｎｄｓｉｎｇｌｅｈｕｍｐｃａｍｅｌ，ｗｉｌｄｂｏａｒ，ｈｏｒｓｅａｎｄＡｆｒｉｃａｎｗｉｌｄｄｏｎｋｅｙ，ｈｕｍａｎａｎｄｍａｃａｑｕｅｗｅｒｅ１００％，９８％，１００％，９８％，９１％，９１％，７８％，８５％，８５％，８１％ａｎｄ９０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＣＡＲＴｐｒｏ⁃ ｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｅｄＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇｉｔｔｏｂｅａｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｌａｉｄａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＡＲＴｇｅｎｅｉｎｂｕｆｆａｌｏｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＡＲＴ；ｂｕｆｆａｌｏ；ｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ可卡因－苯丙胺调节转录肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍ⁃ ｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ＣＡＲＴ）广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统，被认为是参与食物摄入调控的主要无食欲肽［１］。ＣＡＲＴ是一种关键的神经递质和激素，参与调节多种生物过程，包括食物摄入、维持体重、奖励和成瘾、应激反应、心理刺激效应和内分泌功能，并被报道与家畜繁殖力、生产性能有收稿日期：２０１９－０３－２１；修回日期：２０１９－１２－１６基因项目：广西科技计划项目（桂科ＡＢ１６３８００４０）；广西水牛研究所基本科研业务费项目（水牛基１８０５０３）第一作者：于农淇（１９９１－）：女，壮族，硕士 ∗ 通信作者：杨春艳，副研究员，研究方向为动物遗传育种与繁殖，Ｅ－ｍａｉｌ：８６７４８２２７＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ。关［２－４］。水牛ＣＡＲＴ基因（ＧｅｎｅＩＤ：１０２４１３６８２，ＮＷ＿００５７８５８１３）全长为２０５９ｂｐ，有３个ＣＤＳ区，ｍＲＮＡ全长７７５ｂｐ，ＣＤＳ全长３１２ｂｐ。前人对水牛ＣＡＲＴ及其基因的研究不多，尤其缺少奶水牛上该基因结构、表达蛋白分析的相关研究。本研究通过克隆奶水牛ＣＡＲＴ基因ＣＤＳ区序列，分析研究其编码蛋白质的氨基酸结构及蛋白定位、互作，丰富了ＣＡＲＴ基因数据信息，为今后ＣＡＲＴ对水牛内分泌和生长繁殖作用的研究提供数据支撑。１材料与方法１􀆰 １材料试验所用水牛卵巢组织样本来自广西南宁屠宰畜牧与兽医２０２０年第５２卷第２期 ·１·

Animal Husbandry Veterinary Medicine 2020 Vol. 52 No. 2 场,卵巢离体后立刻放入液氮中保存,转移至实验室 TRIzol加入0.6mL异丙醇,混匀放置5~10min,4 后置于液氮罐中待用。 ℃12000r/min离心15min。每毫升 trizol加入1 PremiⅸxTq酶、DL2000 DNA marker、反转录试mL75%乙醇,温和震荡使沉淀悬浮,4℃7500r 剂盒、pMDl8-T载体、T4连接酶、DH5α感受态大min离心5min。弃去酒精,所得沉淀室温干燥5~10 肠杆菌购自 TaKara公司,DNA纯化回收试剂盒、质min后用60℃DEPC处理纯净水溶解,紫外分光光粒小提试剂盒购自天根公司,TRol试剂、氯仿、无度计检测浓度及质量。水乙醇等试剂购自天地扬公司。依照反转录试剂盒操作说明操作反转录cDNA。 1.2方法所得cDNA溶液置于-20℃保存。 1.2.1水牛卵巢组织RNA提取及反转录 1.2.2引物设计与合成将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵,加入液氮反参考NCBI数据库( Gene id:102413682,NW 复、充分研磨。每50~100mg组织加入1 mL TRIzol,005785813)中预测的水牛CART基因mRNA序列再用电动匀浆器充分匀浆1~2min,12000r/min离使用NCBI在线引物设计软件设计引物扩增其CDS区心5min,弃沉淀,每毫升 trizol加入200μ氯仿,序列,引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成手动混匀15s,室温放置10min。4℃1200r/min引物信息见表1。离心15min,取上层水相转移至新的离心管,每毫升表1水牛CART基因扩增引物序列引物名称引物序列(5′→3′) 退火温度/℃ 扩增产物长度/bp F. GCCTACAGACGGTTGACCC CART-CDS 573 R. TIGCTAAAGCCAGACTCCAGG 1.2.3PCR扩增及载体构建 SwisS-modEl(htTp: //swiss-model. expasy. org/)1es PCR反应体系25μL: Premix Taq12.5μL,软件分析蛋白质理化性质、二级和三级结构,利用 dH2O9.5μ,100ng/μ L CDNA模板1μL,10 ng/ PSORT II prediction在线软件(hts:// psort.hge.jn μL上下游引物各1μL,dH2O15.75μL。PCR反应fom2htm)预测CART蛋白的亚细胞定位, STRING 条件:98℃预变性3min;98℃变性30s,62℃退蛋白质互作数据库检索水牛CART蛋白质序列,在火30s.72℃延伸90s,共35个循环;72℃延伸6http://kiharalab.org/web/results.phpjob_id=49337 min,4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检网站上进行蛋白质功能预测。测,用DNA纯化回收试剂盒切胶回收。将回收的 PCR产物与pMD18-T载体通过T4连接酶过夜连接, 2结果与分析转化感受态大肠杆菌DH5α,37℃、100r/min培养12.1水牛CART基因的PCR扩增 h,涂于含有Amp、X-gl、IPTG的IB固体培养基紫外分光光度计检测所得RNA纯度及浓度较好。上,37℃培养12h后挑取阳性单克隆扩增培养。用以反转录所得ωDNA为模板,用所设计引物扩增结果质粒小提试剂盒提取质粒后PCR检测鉴定,将检测如图1所示。由图可见,所设计引物PCR扩增产物阳性的质粒送北京奧科鼎盛生物科技有限公司测序条带清晰且特异性良好,与预期大小相符,可进行下鉴定步试验。 1.2.4生物信息学分析 2.2水牛CART基因克隆及测序 CART基因序列比对及同源性使用NCBI在线分扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌,经挑选培养析,使用MEGA7.0软件构建系统进化树。通过在线后送测序鉴定。菌液PCR产物约570bp大小(图2) 软件 TMHMM2.0(htp:/w.chs.du.dk/ services/为阳性克隆,将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。 TMHMM/)预测分析跨膜结构及信号肽,使用Prot测序结果与NCBI序列对比显示扩增获得序列与 param(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/pot-CART基因CDS区域一致,与预期相同(图3、图 param)、 Prot scale(htts://web. expasy.og/mp/4)。所获得的水牛CART基因CDS序列全长为351 scores55205.txt)、 SOPMA(htp://npsa- pbil. ibep.f/bp,编码116个氨基酸。 cgi-bin/npsa_automat. pl? page= npsa_sopma. html)

场，卵巢离体后立刻放入液氮中保存，转移至实验室后置于液氮罐中待用。ＰｒｅｍｉｘＴａｑ酶、ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ、反转录试剂盒、ｐＭＤ１８－Ｔ载体、Ｔ４连接酶、ＤＨ５α 感受态大肠杆菌购自ＴａＫａＲａ公司，ＤＮＡ纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根公司，ＴＲＩｚｏｌ试剂、氯仿、无水乙醇等试剂购自天地扬公司。１􀆰 ２方法１􀆰 ２􀆰 １水牛卵巢组织ＲＮＡ提取及反转录将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵，加入液氮反复、充分研磨。每５０～１００ｍｇ组织加入１ｍＬＴＲＩｚｏｌ，再用电动匀浆器充分匀浆１～２ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃沉淀，每毫升ＴＲＩｚｏｌ加入２００ μＬ氯仿，手动混匀１５ｓ，室温放置１０ｍｉｎ。４ ℃ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上层水相转移至新的离心管，每毫升ＴＲＩｚｏｌ加入０􀆰 ６ｍＬ异丙醇，混匀放置５～１０ｍｉｎ，４ ℃ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。每毫升ＴＲＩｚｏｌ加入１ｍＬ７５％乙醇，温和震荡使沉淀悬浮，４ ℃ ７５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。弃去酒精，所得沉淀室温干燥５～１０ｍｉｎ后用６０ ℃ ＤＥＰＣ处理纯净水溶解，紫外分光光度计检测浓度及质量。依照反转录试剂盒操作说明操作反转录ｃＤＮＡ。所得ｃＤＮＡ溶液置于－２０ ℃保存。１􀆰 ２􀆰 ２引物设计与合成参考ＮＣＢＩ数据库（ＧｅｎｅＩＤ：１０２４１３６８２，ＮＷ＿００５７８５８１３）中预测的水牛ＣＡＲＴ基因ｍＲＮＡ序列，使用ＮＣＢＩ在线引物设计软件设计引物扩增其ＣＤＳ区序列，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。引物信息见表１。表１水牛ＣＡＲＴ基因扩增引物序列引物名称引物序列（５′ →３′ ）退火温度／ ℃ 扩增产物长度／ｂｐＣＡＲＴ－ＣＤＳＦ：ＧＣＣＴＡＣＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＣＣＣＲ：ＴＴＧＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧ６０５７３１􀆰 ２􀆰 ３ＰＣＲ扩增及载体构建ＰＣＲ反应体系２５ μＬ：ＰｒｅｍｉｘＴａｑ１２􀆰 ５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ９􀆰 ５ μＬ，１００ｎｇ／ μＬｃＤＮＡ模板１ μＬ，１０ｎｇ／ μＬ上下游引物各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１５􀆰 ７５ μＬ。ＰＣＲ反应条件：９８ ℃ 预变性３ｍｉｎ；９８ ℃ 变性３０ｓ，６２ ℃ 退火３０ｓ，７２ ℃延伸９０ｓ，共３５个循环；７２ ℃ 延伸５ｍｉｎ，４ ℃ 保存。ＰＣＲ产物用２％琼脂糖凝胶电泳检测，用ＤＮＡ纯化回收试剂盒切胶回收。将回收的ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体通过Ｔ４连接酶过夜连接，转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，３７ ℃ 、１００ｒ／ｍｉｎ培养１ｈ，涂于含有Ａｍｐ、Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的ＬＢ固体培养基上，３７ ℃培养１２ｈ后挑取阳性单克隆扩增培养。用质粒小提试剂盒提取质粒后ＰＣＲ检测鉴定，将检测阳性的质粒送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定。１􀆰 ２􀆰 ４生物信息学分析ＣＡＲＴ基因序列比对及同源性使用ＮＣＢＩ在线分析，使用ＭＥＧＡ７􀆰 ０软件构建系统进化树。通过在线软件ＴＭＨＭＭ２􀆰 ０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）预测分析跨膜结构及信号肽，使用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔ⁃ ｐａｒａｍ）、Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｍｐ／ｓｃｏｒｅｓ１５５２０５􀆰 ｔｘｔ）、ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）在线软件分析蛋白质理化性质、二级和三级结构，利用ＰＳＯＲＴＩＩｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ在线软件（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｓｏｒｔ．ｈｇｃ．ｊｐ／ｆｏｒｍ２􀆰 ｈｔｍｌ）预测ＣＡＲＴ蛋白的亚细胞定位，ＳＴＲＩＮＧ蛋白质互作数据库检索水牛ＣＡＲＴ蛋白质序列，在ｈｔｔｐ：／／ｋｉｈａｒａｌａｂ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｒｅｓｕｌｔｓ．ｐｈｐ？ｊｏｂ＿ｉｄ＝４９３３７网站上进行蛋白质功能预测。２结果与分析２􀆰 １水牛ＣＡＲＴ基因的ＰＣＲ扩增紫外分光光度计检测所得ＲＮＡ纯度及浓度较好。以反转录所得ｃＤＮＡ为模板，用所设计引物扩增结果如图１所示。由图可见，所设计引物ＰＣＲ扩增产物条带清晰且特异性良好，与预期大小相符，可进行下一步试验。２􀆰 ２水牛ＣＡＲＴ基因克隆及测序扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌，经挑选培养后送测序鉴定。菌液ＰＣＲ产物约５７０ｂｐ大小（图２）为阳性克隆，将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。测序结果与ＮＣＢＩ序列对比显示扩增获得序列与ＣＡＲＴ基因ＣＤＳ区域一致，与预期相同（图３、图４）。所获得的水牛ＣＡＲＴ基因ＣＤＳ序列全长为３５１ｂｐ，编码１１６个氨基酸。 ·２· ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０Ｖｏｌ􀆰 ５２Ｎｏ􀆰 ２

Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１～３􀆰 ＰＣＲ产物图１水牛ＣＡＲＴ基因ＰＣＲ产物电泳分析Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；ｎｅｇ－１，ｎｅｇ－２，ｎｅｇ－３􀆰 阴性克隆ＰＣＲ产物；ｐｏｓ－１􀆰 阳性克隆ＰＣＲ产物图２水牛ＣＡＲＴ基因阳性单克隆ＰＣＲ产物电泳分析图３水牛ＣＡＲＴ基因克隆测序及预测的蛋白编码图４水牛ＣＡＲＴ基因组序列结构示意图２􀆰 ３水牛ＣＡＲＴ基因同源性及系统进化树分析ＮＣＢＩ序列相似性分析（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）对所得水牛序列与ＧｅｎＢａｎｋ中与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼与单峰驼、野猪、马和驴、人类与猕猴基因序列进行比对分析，使用Ｍｅｇａ７􀆰 ０软件构建系统进化树，参考序列及相似性分析结果见表２。所得水牛ＣＡＲＴ基因序列与美洲野牛、普通牛相似程度为１００％，与野牦牛、羊相似程度为９８％，与双峰驼、单峰驼相似程度为９１％，与猕猴相似程度为９１％，与马、驴相似程度为８５％，与人类、野猪相似程度分别为８１％、７８％。Ｍｅｇａ７􀆰 ０分析结果见图５，由图可知水牛与黄牛、牦牛和美洲野牛，以及绵羊最早聚为一类，同源性较高，说明ＣＡＲＴ基因在多胃反刍动物中保守性较强。单峰驼与双峰驼、野猪、马与驴各聚为一类，共３条分支，与牛羊共聚为一大分支，人类与猕猴聚为一类，为另一大分支。聚类分析可见马与驴分化最早，最晚为单峰驼与双峰驼。畜牧与兽医２０２０年第５２卷第２期 ·３·

表２水牛ＣＡＲＴ基因与１１个物种编码区相似性分析物种Ｅ值／随机匹配可能性与水牛基因匹配一致性／％参考序列美洲野牛（Ｂｉｓｏｎｂｉｓｏｎｂｉｓｏｎ）７􀆰 ００Ｅ－１０７１００ＸＭ＿０１０８５３５６９．１野牦牛（Ｂｏｓｍｕｔｕｓ）０９８ＣＰ０２７０８８􀆰 １普通牛（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）０１００ＡＹ６０３９７２􀆰 １羊（Ｏｖｉｓａｒｉｅｓ）４􀆰 ００Ｅ－９９９８ＸＭ＿０１５１０１１９０􀆰 １双峰驼（Ｃａｍｅｌｕｓｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）７􀆰 ００Ｅ－７４９１ＸＭ＿０１０９４９３１３􀆰 １单峰驼（Ｃａｍｅｌｕｓｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）１􀆰 ００Ｅ－７３９１ＸＭ＿０１０９７４９７６􀆰 １野猪（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ）０７８ＥＦ５８１８３８􀆰 １马（Ｅｑｕｕｓｃａｂａｌｌｕｓ）２􀆰 ００Ｅ－５４８５ＸＭ＿０２３６１８２２６􀆰 １驴（Ｅｑｕｕｓａｓｉｎｕｓ）１􀆰 ００Ｅ－５３８５ＸＭ＿０１４８５１９４４􀆰 １人类（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）３􀆰 ００Ｅ－１８０８１ＮＧ＿０１５９８８􀆰 １猕猴（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）２􀆰 ００Ｅ－５７９０ＮＭ＿００１２６５８７７􀆰 １图５ＣＡＲＴ基因系统进化树２􀆰 ４水牛ＣＡＲＴ蛋白理化性质分析经ＰｒｏｔＰａｒａｍ在线软件预测显示，水牛ＣＡＲＴ基因由１１６个氨基酸残基组成，分子式为Ｃ５６６Ｈ９４９Ｎ１５５Ｏ１６３Ｓ８，分子量为１２７９０􀆰 １８，带负电荷的残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为１５个，带正电残基总数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为１７个，理论ｐＩ值为８􀆰 ２２，属于碱性蛋白。消光值在４８４５～４４７０之间，不稳定性指数（ Ⅱ）计算为３８􀆰 ６７，属于稳定蛋白。Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ在线预测分析显示，水牛ＣＡＲＴ蛋白的总平均亲水性为－０􀆰 ００６，属于两性氨基酸（图６）。图６水牛ＣＡＲＴ基因蛋白疏水性分析 ·４· ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０Ｖｏｌ􀆰 ５２Ｎｏ􀆰 ２

畜牧与兽医2020年第52卷第2期 2.5水牛CART蛋白信号肽及跨膜结构预测分析 2.6水牛CART蛋白二级和三级结构预测及亚细胞 TMHMM2.0预测结果显示,水牛CART蛋白非定位跨膜蛋白,序列1~30位氨基酸处存在1段N端信号使用 SOPMA分析显示,水牛CART蛋白二级结肽,是分泌蛋白(图7) 构主要为α螺旋,无规则卷曲和延伸链,分别占 50.86%、37.93%、10.34%,属于α类蛋白质(图 8)。采用 SWISS-MODEL在线软件预测水牛CART蛋白三级结构,结果显示该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,与二级结构预测结果一致。利用 PSORTⅡ prediction在线软件预测CART蛋白的亚细胞定位,结果显示该蛋白在在细胞外、线粒体、空泡、细胞核的分布比例分别为667%、11.1% 跨膜区膜内区膜外区 l1.1%、11.1%。图7水牛CART蛋白跨膜结构预测分析结果长竖线.α螺旋;中长竖线.延伸链;短竖线.无规则卷曲图8水牛CART蛋白二级结构预测 2.7蛋白质互作及功能预测使用 STRING蛋白质互作数据库检索水牛CART 蛋白质序列,检索到该序列与牛可卡因-苯丙胺调解转录肽前肽( cocaine- and amphetamine- regulated tran- AGRP script peptide concentrations, CARTPT)蛋白质一致, 互作网络结果如下图。由图可见并不能找到有确切证 CDI 据(论文和试验数据)证明与 CARTPT互作的蛋白 CARTPT 质,与之共表达的蛋白有白细胞分化抗原19( cluster of differentiation19,CD19)、神经肽Y( neuropeptide NerSEs Y,NPY)和促肾上腺皮质激素释放激素( corticotro- pin releasing hormone,CRH),其余蛋白质均为文本关联(图9)。在htp:// kiharalab.og/web/ index.php 网站上进行蛋白质功能预测,预测结果显示,未能预测出达到置信度的分子功能,找到35条低置信度生化通路,PFP分数最高的5条为G蛋白偶联受体信 CARTPT:可卡因-苯丙胺调解转录肽前肽;CD19:白细胞分化号通路、突触传递、细胞饥锇反应、神经冲动传递的抗原19;NPY:神经肽Y;CHH:促肾上腺皮质激素释放激素正向调节和骨吸收负调节。亚细胞定位预测结果为细 POMC:阿黑皮素原;CCK:胆囊收缩素;LEP:瘦素;AGRP:刺鼠基因相关蛋白;cR℃3:环状腺嘌呤核糖核苷酸响应蛋白3 胞间隙和分泌泡,与 PSORTⅡ prediction预测结果Nss9:.肿瘤坏死因子受体超家族成员9:MLN:间皮素深色线为致共表达,浅色线为基因相邻图9水牛CART基因蛋白质互作数据库检索结果

２􀆰 ５水牛ＣＡＲＴ蛋白信号肽及跨膜结构预测分析ＴＭＨＭＭ２􀆰 ０预测结果显示，水牛ＣＡＲＴ蛋白非跨膜蛋白，序列１～３０位氨基酸处存在１段Ｎ端信号肽，是分泌蛋白（图７）。图７水牛ＣＡＲＴ蛋白跨膜结构预测分析结果２􀆰 ６水牛ＣＡＲＴ蛋白二级和三级结构预测及亚细胞定位使用ＳＯＰＭＡ分析显示，水牛ＣＡＲＴ蛋白二级结构主要为 α 螺旋，无规则卷曲和延伸链，分别占５０􀆰 ８６％、３７􀆰 ９３％、１０􀆰 ３４％，属于 α 类蛋白质（图８）。采用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ在线软件预测水牛ＣＡＲＴ蛋白三级结构，结果显示该蛋白主要由 α－螺旋和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致。利用ＰＳＯＲＴ Ⅱ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ在线软件预测ＣＡＲＴ蛋白的亚细胞定位，结果显示该蛋白在在细胞外、线粒体、空泡、细胞核的分布比例分别为６６􀆰 ７％、１１􀆰 １％、１１􀆰 １％、１１􀆰 １％。长竖线． α 螺旋；中长竖线．延伸链；短竖线．无规则卷曲图８水牛ＣＡＲＴ蛋白二级结构预测２􀆰 ７蛋白质互作及功能预测使用ＳＴＲＩＮＧ蛋白质互作数据库检索水牛ＣＡＲＴ蛋白质序列，检索到该序列与牛可卡因－苯丙胺调解转录肽前肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎ⁃ ｓｃｒｉｐｔｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ＣＡＲＴＰＴ）蛋白质一致，互作网络结果如下图。由图可见并不能找到有确切证据（论文和试验数据）证明与ＣＡＲＴＰＴ互作的蛋白质，与之共表达的蛋白有白细胞分化抗原１９（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１９，ＣＤ１９）、神经肽Ｙ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ，ＮＰＹ）和促肾上腺皮质激素释放激素（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏ⁃ ｐｉｎｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ，ＣＲＨ），其余蛋白质均为文本关联（图９）。在ｈｔｔｐ：／／ｋｉｈａｒａｌａｂ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ网站上进行蛋白质功能预测，预测结果显示，未能预测出达到置信度的分子功能，找到３５条低置信度生化通路，ＰＦＰ分数最高的５条为Ｇ蛋白偶联受体信号通路、突触传递、细胞饥饿反应、神经冲动传递的正向调节和骨吸收负调节。亚细胞定位预测结果为细胞间隙和分泌泡，与ＰＳＯＲＴ Ⅱ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ预测结果一致。ＣＡＲＴＰＴ：可卡因－苯丙胺调解转录肽前肽；ＣＤ１９：白细胞分化抗原１９；ＮＰＹ：神经肽Ｙ；ＣＲＨ：促肾上腺皮质激素释放激素；ＰＯＭＣ：阿黑皮素原；ＣＣＫ：胆囊收缩素；ＬＥＰ：瘦素；ＡＧＲＰ：刺鼠基因相关蛋白；ＣＲＴＣ３：环状腺嘌呤核糖核苷酸响应蛋白３；ＴＮＦＲＳＦ９：肿瘤坏死因子受体超家族成员９；ＭＳＬＮ：间皮素深色线为共表达，浅色线为基因相邻图９水牛ＣＡＲＴ基因蛋白质互作数据库检索结果畜牧与兽医２０２０年第５２卷第２期 ·５·

Animal Husbandry Veterinary Medicine 2020 Vol. 52 No. 2 3讨论损伤疾病治疗上具有潜在用途。水牛具有耐热、耐粗饲和抗病性强等特点,是南结论方地区一种重要家畜。近年来随着国外优良品种的引本试验成功克隆了水牛CART基因CDS区,CDS 进,水牛的经济价值进一步提高,但繁殖力低下问题区全序列长为312bp,编码116个氨基酸。对所得核直未能解决,是限制水牛产业发展的重要因素。研酸序列和蛋白质结构分析预测显示,水牛CART基因究和调査水牛繁殖相关基因,从分子层面对其特性进序列与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼与单行解释,是提高水牛繁殖力的一个重要途径。CART峰驼、野猪、马和非洲野驴、人类与猕猴相似程度分是一种类生长抑制素多肽,同时兼有神经递质功能。别为100%、%8%、100%、98%、91%、91%、78%、85%、 CART可在中枢神经系统、外周交感神经、感觉或肠85%、81%、90%,说明该基因在反刍动物间有较高同神经元以及神经内分泌细胞(包括胰岛细胞、胃肠源性,CART蛋白含有N端信号肽,是一种分泌蛋道黏膜层以及甲状腺和肾上腺髓质)中产生,在下白,功能与神经、辅酶和离子结合相关。丘脑垂体功能的调节中起着重要的作用,一般被认为能够抑制食物摄入、刺激能量消耗和调节下丘脑-垂参考文献体轴,影响动物的生产性状及繁殖性能6。本试验以广西本地水牛为研究对象,对水牛CART基因[] MAKOWSKA K, RYTEL L, LECH P,etal. Cocaine- and amphet cDNA进行了测序并进行了蛋白质结构及功能预测分 amine-regulated transcript( CART) peptide in the enteric nen 析,在 Kiharalab的预测结果中,PFP分值前二即为 system of the porcine esophagus [J.C R Biol, 2018, 341(6) 325-333 神经肽激素活性和催化活性,其余功能则与构成辅(2]LAUJ, HERZOG H. CART in the regulation of appetite and energ 酶、离子结合相关。但由于 Kiharalab是基于已有研 homeostasis [J]. Front Neurosci, 2014, 8: 313 究进行预测分析,而该基因和蛋白质在家畜上的研究[3]李鹏飞,毕锡麟,王错等.CART在不同发育阶段牛卵泡颗粒细太少,预测结果并没有达到置信分值,仅能作为一个胞中的表达和定位[J].中国农业科学,2016,49(12) 参考。 2389-2396 [4]赵栓平,徐磊,贾玉堂.大别山牛CART基因多态性与体尺性状 CART也参与调控颗粒细胞(GCs)卵泡刺激素相关性研究[J].中国牛业科学,2017,43(5):14-17 信号转导,在与选择优势卵泡相关的雌二醇生产负调 [5] OPONOWICZ A, KOZEOWSKA A, GONKOWSKI S, et al.Chan- 控中具有潜在的特定阶段调节作用。据Ma等 tran- 报道,体外受精妇女的体重指数、GCs中CART script-containing neural structures in the human colon affected by RNA的表达量以及卵泡液中CART肽的水平均呈显 the neoplastic process [. Int J Mol Sci, 2018, 19(2):414. 著正相关,而CART有抑制GC芳香化酶mRNA的表 [6] MORTENSEN A H, CAMPER S A. Cocaine-and amphetamine reg- 达和类固醇生成,导致雌二醇合成降低,卵巢卵泡发 ulated transcript( CART) peptide is expressed in precursor cells and 生改变。Lw等报道了CART基因控制肉牛颗粒细 atotropes of the mouse pituitary gland [. PLos One,2016,11 胞雌二醇表达,说明CART可能与家畜繁殖性能相 (9):c0160068 关。本试验还对cDNA进行了同源性和MEGA分析,7)sENA,Bc0pA,J川 IENEZ-KRASS. Cocaine-ar 结果显示CART基因在反刍动物(牛、羊、水牛) amphetamine-regulated transcript regulation of follicle-stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells [J].Endocri- 中保守性较强,据此也可以推测CART在这几种动物 nology,2007,148(9):4400-4410. 中功能相近。根据赵栓平等的报道,大别山牛[8]MAx, HAYES E, PRIZANT H,eta.lpin- induced CART( CART基因SNP突变与其体尺性状相关,可以大胆推 ine-and amphetamine-regulated transcript)is a novel intraovarian 测CART与水牛体尺性状、繁殖性能也存在关系。根 mediator of obesity ted infertility in females [ J] 据cDNA进行的蛋白质结构预测分析结果显示,水牛 Endocrinology,2016,157(3):1248-1257 [9 LV L, JIMENEZ-KRASSEL F, SEN A, et al. Evidence supporting CART蛋白属于两性蛋白,其上存在一段N端信号肽,可能是一种分泌蛋白。在对水牛CART蛋白质功 (CARTPT) in control of granulosa cell estradiol production 能的预测中,预测到其具有与辅酶、离子等结合的功 associated with dominant follicle selection in cattle [J].Biol 能,预测到的相关通路多为神经递质和基础代谢,这 Reprod,2009,81(3):580-586. 说明CABT基因与蛋白质具有多种功能。王路娜[10王路娜,陈一冰,张均等可卡因-苯丙胶调节转录肽对缺血再灌注模型小鼠皮质突触可塑性的影响[J].中国脑血管病杂等报道了注射CART可降低缺血-再灌注(L/R) 017,14(3);127-132 小鼠皮质梗死区周围突触的减少,说明CART在神经

３讨论水牛具有耐热、耐粗饲和抗病性强等特点，是南方地区一种重要家畜。近年来随着国外优良品种的引进，水牛的经济价值进一步提高，但繁殖力低下问题一直未能解决，是限制水牛产业发展的重要因素。研究和调查水牛繁殖相关基因，从分子层面对其特性进行解释，是提高水牛繁殖力的一个重要途径。ＣＡＲＴ是一种类生长抑制素多肽，同时兼有神经递质功能。ＣＡＲＴ可在中枢神经系统、外周交感神经、感觉或肠神经元以及神经内分泌细胞（包括胰岛细胞、胃肠道黏膜层以及甲状腺和肾上腺髓质）中产生，在下丘脑垂体功能的调节中起着重要的作用，一般被认为能够抑制食物摄入、刺激能量消耗和调节下丘脑－垂体轴，影响动物的生产性状及繁殖性能［５－６］。本试验以广西本地水牛为研究对象，对水牛ＣＡＲＴ基因ｃＤＮＡ进行了测序并进行了蛋白质结构及功能预测分析，在Ｋｉｈａｒａｌａｂ的预测结果中，ＰＦＰ分值前二即为神经肽激素活性和催化活性，其余功能则与构成辅酶、离子结合相关。但由于Ｋｉｈａｒａｌａｂ是基于已有研究进行预测分析，而该基因和蛋白质在家畜上的研究太少，预测结果并没有达到置信分值，仅能作为一个参考。ＣＡＲＴ也参与调控颗粒细胞（ＧＣｓ）卵泡刺激素信号转导，在与选择优势卵泡相关的雌二醇生产负调控中具有潜在的特定阶段调节作用［７－８］。据Ｍａ等［８］报道，体外受精妇女的体重指数、ＧＣｓ中ＣＡＲＴｍＲＮＡ的表达量以及卵泡液中ＣＡＲＴ肽的水平均呈显著正相关，而ＣＡＲＴ有抑制ＧＣ芳香化酶ｍＲＮＡ的表达和类固醇生成，导致雌二醇合成降低，卵巢卵泡发生改变。Ｌｖ等［９］报道了ＣＡＲＴ基因控制肉牛颗粒细胞雌二醇表达，说明ＣＡＲＴ可能与家畜繁殖性能相关。本试验还对ｃＤＮＡ进行了同源性和ＭＥＧＡ分析，结果显示ＣＡＲＴ基因在反刍动物（牛、羊、水牛）中保守性较强，据此也可以推测ＣＡＲＴ在这几种动物中功能相近。根据赵栓平等［４］的报道，大别山牛ＣＡＲＴ基因ＳＮＰ突变与其体尺性状相关，可以大胆推测ＣＡＲＴ与水牛体尺性状、繁殖性能也存在关系。根据ｃＤＮＡ进行的蛋白质结构预测分析结果显示，水牛ＣＡＲＴ蛋白属于两性蛋白，其上存在一段Ｎ端信号肽，可能是一种分泌蛋白。在对水牛ＣＡＲＴ蛋白质功能的预测中，预测到其具有与辅酶、离子等结合的功能，预测到的相关通路多为神经递质和基础代谢，这说明ＣＡＲＴ基因与蛋白质具有多种功能。王路娜等［１０］报道了注射ＣＡＲＴ可降低缺血－再灌注（Ｉ／Ｒ）小鼠皮质梗死区周围突触的减少，说明ＣＡＲＴ在神经损伤疾病治疗上具有潜在用途。４结论本试验成功克隆了水牛ＣＡＲＴ基因ＣＤＳ区，ＣＤＳ区全序列长为３１２ｂｐ，编码１１６个氨基酸。对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示，水牛ＣＡＲＴ基因序列与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼与单峰驼、野猪、马和非洲野驴、人类与猕猴相似程度分别为１００％、９８％、１００％、９８％、９１％、９１％、７８％、８５％、８５％、８１％、９０％，说明该基因在反刍动物间有较高同源性，ＣＡＲＴ蛋白含有Ｎ端信号肽，是一种分泌蛋白，功能与神经、辅酶和离子结合相关。参考文献：［１］ＭＡＫＯＷＳＫＡＫ，ＲＹＴＥＬＬ，ＬＥＣＨＰ，ｅｔａｌ．Ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔ⁃ ａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）ｐｅｐｔｉｄｅｉｎｔｈｅｅｎｔｅｒｉｃｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｅｓｏｐｈａｇｕｓ［Ｊ］．ＣＲＢｉｏｌ，２０１８，３４１（６）：３２５－３３３．［２］ＬＡＵＪ，ＨＥＲＺＯＧＨ．ＣＡＲＴｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｐｐｅｔｉｔｅａｎｄｅｎｅｒｇｙｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＮｅｕｒｏｓｃｉ，２０１４，８：３１３．［３］李鹏飞，毕锡麟，王锴等．ＣＡＲＴ在不同发育阶段牛卵泡颗粒细胞中的表达和定位［Ｊ］．中国农业科学，２０１６，４９（１２）：２３８９－２３９６．［４］赵栓平，徐磊，贾玉堂．大别山牛ＣＡＲＴ基因多态性与体尺性状相关性研究［Ｊ］．中国牛业科学，２０１７，４３（５）：１４－１７．［５］ＯＰＯＮＯＷＩＣＺＡ，ＫＯＺŁＯＷＳＫＡＡ，ＧＯＮＫＯＷＳＫＩＳ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｎ⁃ ｇｅｓｉｎｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎ⁃ ｓｃｒｉｐｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｅｕｒａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｃｏｌｏｎａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１８，１９（２）：４１４－４１９．［６］ＭＯＲＴＥＮＳＥＮＡＨ，ＣＡＭＰＥＲＳＡ．Ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅｒｅｇ⁃ ｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）ｐｅｐｔｉｄｅｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｅｓｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｐｉｔｕｉｔａｒｙｇｌａｎｄ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１６，１１（９）：ｅ０１６００６８．［７］ＳＥＮＡ，ＢＥＴＴＥＧＯＷＤＡＡ，ＪＩＭＥＮＥＺ－ＫＲＡＳＳＥＬＦ．Ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｏｌｌｉｃｌｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｂｏｖｉｎｅｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉ⁃ ｎｏｌｏｇｙ，２００７，１４８（９）：４４００－４４１０．［８］ＭＡＸ，ＨＡＹＥＳＥ，ＰＲＩＺＡＮＴＨ，ｅｔａｌ．Ｌｅｐｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＡＲＴ（ｃｏ⁃ ｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）ｉｓａｎｏｖｅｌｉｎｔｒａｏｖａｒｉａｎｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｏｂｅｓｉｔｙ－ｒｅｌａｔｅｄｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙｉｎｆｅｍａｌｅｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１６，１５７（３）：１２４８－１２５７．［９］ＬＶＬ，ＪＩＭＥＮＥＺ－ＫＲＡＳＳＥＬＦ，ＳＥＮＡ，ｅｔａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇａｒｏｌｅｆｏｒｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴＰＴ）ｉｎｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｅｓｔｒａｄｉｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｏｍｉｎａｎｔｆｏｌｌｉｃｌｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ，２００９，８１（３）：５８０－５８６．［１０］王路娜，陈一冰，张均等．可卡因－苯丙胺调节转录肽对缺血－再灌注模型小鼠皮质突触可塑性的影响［Ｊ］．中国脑血管病杂志，２０１７，１４（３）：１２７－１３２． ·６· ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０Ｖｏｌ􀆰 ５２Ｎｏ􀆰 ２