第34卷第4期 病毒学报 2018年6月 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY DO: 10.13242/jcnki. bingduxuebao 003389 恒温扩增HPV检测技术应用于子宫颈癌筛查 的效果评价研究 王林,姜明月2,曹雪芳2,李莉3,秦宇2,吴泽妮?,李婷媛?,吴婷凵,陈汶2 (1.厦门大学分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,公共卫生学院,厦门361102; 2.国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院流行病学研究室,北京100021; 3.新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐830011) 摘要:为了评价人乳头状瘤病毒( Human papillomavirus·HPV)恒温DNA扩增检测技术用于高危型HPV检测和 宫颈癌早期及癌前病变筛查的准确性和可行性。本研究于2016年6月至8月,在我国内蒙古地区招募2774例30 ~64岁有性生活史的妇女进行宫颈癌筛查;采用薄层液基细胞学技术完成细胞学诊断。采用恒温DNA扩增HPV 测技术( Iomega)和第二代杂交捕获技术( Hybrid Capture2,HC2)平行检测宫颈标本;对于 Iomega检测为 HPvl6/HPⅥ18阳性的标本和两种方法检测不一致的标本,使用线性探针法( INNO-LiPA)进行分型验证。以病理 诊断为金标准,评价 Iomega用于筛查宫颈上皮内瘤变( Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)2级及以上患者的 灵敏度和特异度。结果表明, iomega与HC2检测高危型HPV的总一致率为9272%( Kappa=0.74),阳性一致 率为8678%阴性一致率为9377%;以 INNO-LiPA分型结果为标准, Iomega检出HPV16和HPV18的准确率 分别为9697%和8611%。以病理诊断为金标准, Iomega筛查CIN2+的灵敏度和特异度分别为87.76%和 294%。 Iomega能准确检测HPVl6、HPVl8和其他高危型别HPV,有较高的筛査灵敏度和特异度。 关键词:宫颈癌;人乳头状瘤病毒(HPV);筛査;恒温扩增 中图分类号:R3739文献标识码:A文章编号:1000-8721(2018)040498-07 宫颈癌是全世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤这使得 HR-HPV检测成为一种有效的宫颈癌筛查 之一,对全世界妇女尤其是发展中国家妇女造成严技术,有望替代细胞学成为宫颈癌筛查的主要方 重的疾病负担[。宫颈癌的发生、发展是一个漫长法印。第二代杂交捕获检测技术( Hybrid Captu 的过程,从癌前病变进展为宫颈癌大约需要10~202,HC2)是目前国际认可的 HR-HPV DNA检测方 年。通过筛查和干预,可以阻断癌前病变向宫颈癌法,可以检测13种与宫颈癌相关的 HR-HPV 的进展,达到降低宫颈癌的发病率和死亡率的(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、 HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56 目前宫颈癌筛查以细胞学为主,有效降低了宫HPV58、HPV59、HPV68),但无法分型。“人乳头 颈癌发病率,但是在发展中国家宫颈癌的发病率降瘤病毒(15种基因型)并16/18分型核酸检测试剂 低的不明显,主要原因是细胞学制片和诊断需要训盒(恒温扩增荧光法)( Iomega)”是一种基于核酸 练有素的专业人员,且容易受到多种主观因素的影恒温扩增原理的HPV检测技术,可检测15种 响,在卫生资源有限的国家和地区比较难于实施。HPV型别(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33 随着宫颈癌病因学的研究和进展,大量研究表明高HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、 危型HPV( HR-HPV)的持续性感染是宫颈癌发生HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 的必要条件。99%以上的宫颈癌患者中可检测到HPV8)并对HPV16和HPC18具体分型。与 HPV DNA,而HPV阴性者几乎不会发生宫颈HC2相比,该技术能鉴别高风险的HPV6和 癌[。HPV16和HPV18型别是引起宫颈癌最主 IPV18型别,同时增加了HPV53和HPV66型的 要的高危型别,占宫颈浸润癌的近70%。因此,检测。 INNO-LiPA HPV Genotyping Extra试剂盒 ( INNO-LIPA,比利时 Innogenetics公司)是一种基 收稿日期:2018-03-08;修回日期:201804-26 于聚合酶链反应和反向探针杂交原理的HPV基因 作者简介:王林(1991-),男,硕士研究生,从事肿瘤流行病学研 分型技术,可鉴别28种基因型别。 Kleter B等人 究,E-ma lin1217@163.com 大通讯作者:陈汶(1972),男,副研究员,从事肿瘤流行病学研使用 INNO-LiPA对1354例临床样本进行分型检 *. E-mail: chenwen(@ cicams ac cn 测,结果证明该实验与运用MY09/11引物的实验 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
第３４卷 第４期 ２０１８ 年６月 病 毒 学 报 ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＶＩＲＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．４ Ｊｕｎｅ ２０１８ 恒温扩增 ＨＰＶ检测技术应用于子宫颈癌筛查 的效果评价研究 王林１，姜明月２，曹雪芳２，李莉３，秦宇２，吴泽妮２，李婷媛２，吴婷１，陈汶２＊ （１．厦门大学 分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室， 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，公共卫生学院，厦门３６１１０２； ２．国家癌症中心／中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院 流行病学研究室，北京 １０００２１； ３．新疆医科大学 公共卫生学院，乌鲁木齐 ８３００１１） 摘要：为了评价人乳头状瘤病毒（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）恒 温 ＤＮＡ 扩增检测技术用于高危型 ＨＰＶ 检 测 和 宫颈癌早期及癌前病变筛查的准确性和可行性。本研究于２０１６年６月至８月，在我国内蒙古地区招募２７７４例３０ ～６４岁有性生活史的妇女进行宫颈癌筛查；采用薄层液基细胞学技术完成细胞学诊断。采用恒温 ＤＮＡ 扩增 ＨＰＶ 检测技术（Ｉｓｏｍｅｇａ）和第二代杂交捕获技术（ＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ２，ＨＣ２）平行检测宫颈标本；对 于Ｉｓｏｍｅｇａ检 测 为 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８阳性的标本和两种方法检测不一致的标本，使用线性探针法（ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ）进行分型验证。以病理 诊断为金标准，评价Ｉｓｏｍｅｇａ用于筛查宫颈上皮内瘤变（ＣｅｒｖｉｃａｌＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＮｅｏｐｌａｓｉａ，ＣＩＮ）２级及以上患者的 灵敏度和特异度。结果表明，Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２检测 高 危 型 ＨＰＶ 的 总 一 致 率 为９２．７２％（Ｋａｐｐａ＝０．７４），阳 性 一 致 率为８６．７８％，阴性一致率为９３．７７％；以ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 分型结果为标准，Ｉｓｏｍｅｇａ检出 ＨＰＶ１６和 ＨＰＶ１８的准确率 分别为９６．９７％和８６．１１％。以病理诊断为金标准，Ｉｓｏｍｅｇａ筛 查 ＣＩＮ２＋ 的灵敏度和特异度分别为 ８７．７６％ 和 ８２．９４％。Ｉｓｏｍｅｇａ能准确检测 ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８和其他高危型别 ＨＰＶ，有较高的筛查灵敏度和特异度。 关键词：宫颈癌；人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）；筛查；恒温扩增 中图分类号：Ｒ３７３．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７２１（２０１８）０４－０４９８－０７ 收稿日期：２０１８－０３－０８；修回日期：２０１８－０４－２６ 作者简介：王林（１９９１－），男，硕 士 研 究 生，从事肿瘤流行病学研 究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗ＿ｌｉｎ１２１７＠１６３．ｃｏｍ ＊通讯作者：陈汶（１９７２－），男，副 研 究 员，从事肿瘤流行病学研 究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｗｅｎ＠ｃｉｃａｍｓ．ａｃ．ｃｎ 宫颈癌是全世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤 之一，对全世界妇女尤其是发展中国家妇女造成严 重的疾病负担［１］。宫颈癌的发生、发展是一 个 漫 长 的过程，从癌前病变进展为宫颈癌大约需要１０～２０ 年。通过筛查和干预，可以阻断癌前病变向宫颈癌 的 进 展，达到降低宫颈癌的发病率和死亡率的 目的［２］。 目前宫颈癌筛查以细胞学为主，有效降低了宫 颈癌发病率，但是在发展中国家宫颈癌的发病率降 低的不明显，主要原因是细胞学制片和诊断需要训 练有素的专业人员，且容易受到多种主观因素的影 响，在卫生资源有限的国家和地区比较难于实施［３］。 随着宫颈癌病因学的研究和进展，大量研究表明高 危型 ＨＰＶ（ＨＲ－ＨＰＶ）的持续性感染是宫颈癌发生 的必要条件［４］。９９％以上的宫颈癌患者中可检测到 ＨＰＶ ＤＮＡ，而 ＨＰＶ 阴 性 者 几 乎 不 会 发 生 宫 颈 癌［５］。ＨＰＶ１６和 ＨＰＶ１８ 型别是引起宫颈癌最主 要的高危 型 别，占 宫 颈 浸 润 癌 的 近７０％［６］。因 此， 这使得 ＨＲ－ＨＰＶ 检测成为一种有效的宫颈癌筛查 技术，有 望 替 代 细 胞 学 成 为 宫 颈 癌 筛 查 的 主 要 方 法［７］。第二代 杂 交 捕 获 检 测 技 术（ＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ ２，ＨＣ２）是目前国际认可的 ＨＲ－ＨＰＶ ＤＮＡ 检测方 法，可 以 检 测 １３ 种 与 宫 颈 癌 相 关 的 ＨＲ－ＨＰＶ （ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８），但 无 法 分 型。“人 乳 头 瘤病毒（１５种 基 因 型）并１６／１８分 型 核 酸 检 测 试 剂 盒（恒温 扩 增－荧 光 法）（Ｉｓｏｍｅｇａ）”是 一 种 基 于 核 酸 恒 温 扩 增 原 理 的 ＨＰＶ 检 测 技 术，可 检 测 １５ 种 ＨＰＶ 型 别 （ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ６８）并 对 ＨＰＶ１６ 和 ＨＰＣ１８ 具 体 分 型。 与 ＨＣ２ 相 比，该 技 术 能 鉴 别 高 风 险 的 ＨＰＶ１６ 和 ＨＰＶ１８型别，同 时 增 加 了 ＨＰＶ５３和 ＨＰＶ６６型 的 检测。ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ＨＰＶＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＥｘｔｒａ试剂盒 （ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ，比利时Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ公司）是 一 种 基 于聚合酶链反应和反向探针杂交原理的 ＨＰＶ 基因 分型技术，可鉴别２８种基因型别。ＫｌｅｔｅｒＢ［８］等人 使用ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 对１３５４例临床样本进行分型检 测，结果证 明 该 实 验 与 运 用 ＭＹ０９／１１引 物 的 实 验 DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003389
王林,等.恒温扩増HPⅤ检测技术应用于子宫颈癌筛査的效果评价硏究 结果保持高度一致,灵敏度要高于GP5+/6+引 lial lesion,HISL),鳞状细胞癌( Squamous Cell 物,是一种可靠、有效的检测 HPV DNA的方法 Carcinoma,SCC)。 本研究通过比较 Iomega与HC2检测HR-HPV的4HPⅤVDNA检测 致性,以及以 INNO-LiPA结果为标准,评价Iso41主要仪器与试剂 ega检测HPV16和HPV18的准确性,探讨Iso 五通道荧光定量PCR检测系统(江苏中生方政 mega HPⅤ检测技术在宫颈癌及癌前病变筛查中的公司)、干式恒温器(江苏海门其林贝尔仪器公司)、 可行性及应用价值 omega HPV检测试剂盒(江苏中生方政公司); HC2检测系统(DML2000基因杂交信号放大仪、 材料与方法 旋涡振荡器、自动恒温加热仪)及HC2检测试剂盒 (德国 QIAGEN公司)、水浴锅(北京长风仪器公 1研究对象 司);杂交炉( Fisher Scientific公司)、96孔PCR热 本研究于2016年6月至8月在我国内蒙古地循环仪( Applied Biosystems9700)、 Auto-LiPA48 区招募2774例年龄在30~64岁之间、有性生活仪( Innogenetics)、 QIAamp96DNA提取试剂盒 史、宫颈完整、自愿接受筛查的非妊娠妇女,所有参(德国 QIAGEN公司)、 INNO-LIPA HPV基因扩 加本研究的妇女均签署知情同意书。研究方案经中增试剂盒( Innogenetics)。 国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准,批准文号42 Iomega检测 为15-146/1073。 吸取1ml存放在细胞保存液中的样本于离心 2标本采集与处理 管中,高速离心10min,再除去上清液,加入100d 由内蒙古杭锦旗妇幼保健院的妇科医生采用宫裂解液,充分混匀。放入干式恒温器(中生方政)中 颈细胞采样刷收集宫颈脱落细胞标本,分别保存于95℃加热15min。吸取2μl处理好的样本加入反 PreservCyt( ThinPrep, Hologic, Bedford,MA,应液中,加入阴、阳性质控。将反应管放置于五通道 USA)细胞保存液和样品转移培养基( Specimen荧光定量PCR检测系统(中生方政),设置恒温反应 Transport Medium,STM, QIAGEN,德国)中,前者程序:60℃,75min,每分钟相当于一个循环。同一 用于 Iomega检测和薄层液基细胞学诊断,后者用反应管中由检测仪器四种荧光检测通道(FAM、 于HC2检测。所有细胞学标本均运输至中国医学CY5、ROX、VIC),分别检测13种HR-HPV 科学院肿瘤医院中心实验室,进行盲法检测和诊断。HPⅥ16、HPV18及内参(人β血红蛋白基因),内参 3薄层液基细胞学诊断 用于评估样本质量及核酸扩增抑制因素。待检样本 对存放在 PreservCyt细胞保存液的标本进行在FAM、CY5、ROX荧光检测通道扩增过程中没有 预处理,将标本中的黏液、血液和炎症细胞与上皮细明显呈指数增长的荧光信号,内参在VIC荧光检测 胞分离,采用 ThinPrep2000系统全自动细胞检测通道循环值≤65min,判断为阴性;若FAM、CY5 制备仪制成直径为2cm的薄层细胞涂片,95%酒精ROX荧光检测通道循环值≤65min,内参在ⅤIC荧 固定并巴氏染色。细胞学玻片由中国医学院肿瘤医光检测通道扩增过程中有或没有明显呈指数增长的 院细胞学专家采用TBS( the Bethesda System)分级荧光信号,均判断为阳性。检测阈值为1000拷 系统进行细胞学分级诊断,即无上皮内病变(Nega贝/mL tive for Intraepithelial Lesion or Malignancy, 4.3 HC2 #e iAy NILM),意义未明确的非典型鳞状上皮细胞增生 分别吸取500山、1000d含有指示剂的裂解液加 ( Atypical Squarnous Cells of Undetermined Signif-入阳性校准品和阴性校准品中,65℃水浴45min进 ance,ASC-US),非典型腺上皮细胞( Atypical行裂解。吸取75μl裂解好的待测标本和阴、阳性对 Glandular cells,AGC),非典型鳞状细胞不除外高照加入微孔板中,每孔再加入25μ配好的高危型探 级鳞状上皮内病变( Atypical Squamous Cells,Can-针工作液,65℃孵育1h。将各孔液体转移至捕获孔 not Exclude High Grade Intmepithelial Lesion,中,振荡1h,弃掉液体。每孔加入75μ的Q05%叠 AsSC-H),低级别鳞状上皮内病变( Low Grade氮化钠缓冲溶液和碱性磷酸酶结合抗体,20℃~25℃ Squamous Intraepithelial Lesion,LISL),高级别鳞放置Q5h,弃掉液体,用洗液用力冲洗各孔6次,反 状上皮内病变( High Grade Squamous Intraepithe-转放置5min。每孔加入75山l荧光底物,置于DML 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
结果保持 高 度 一 致，灵 敏 度 要 高 于 ＧＰ５＋／６＋ 引 物，是一 种 可 靠、有 效 的 检 测 ＨＰＶ ＤＮＡ 的 方 法。 本研究通过比较Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２检测 ＨＲ－ＨＰＶ 的 一致性，以及以ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 结果为标准，评价Ｉｓｏ－ ｍｅｇａ检测 ＨＰＶ１６和 ＨＰＶ１８的 准 确 性，探 讨Ｉｓｏ－ ｍｅｇａＨＰＶ 检测技术在宫颈癌及癌前病变筛查中的 可行性及应用价值。 材料与方法 １ 研究对象 本研究于２０１６年６月至８月在我国内蒙古地 区招募２７７４ 例 年 龄 在 ３０～６４ 岁 之 间、有 性 生 活 史、宫颈完整、自愿接受筛查的非妊娠妇女，所有参 加本研究的妇女均签署知情同意书。研究方案经中 国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准，批准文号 为１５－１４６／１０７３。 ２ 标本采集与处理 由内蒙古杭锦旗妇幼保健院的妇科医生采用宫 颈细胞采样刷收集宫颈脱落细胞标本，分别保存于 ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ， Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）细 胞 保 存 液 和 样 品 转 移 培 养 基 （Ｓｐｅｃｉｍｅｎ ＴｒａｎｓｐｏｒｔＭｅｄｉｕｍ，ＳＴＭ，ＱＩＡＧＥＮ，德国）中，前者 用于Ｉｓｏｍｅｇａ检测和薄层液基细胞学诊断，后 者 用 于 ＨＣ２检测。所有细胞学标本均运输至中国医学 科学院肿瘤医院中心实验室，进行盲法检测和诊断。 ３ 薄层液基细胞学诊断 对存放在 ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ细胞保存液的标本进行 预处理，将标本中的黏液、血液和炎症细胞与上皮细 胞分离，采用 ＴｈｉｎＰｒｅｐ２０００系统全自动细胞检测 制备仪制成直径为２ｃｍ 的薄层细胞涂片，９５％酒精 固定并巴氏染色。细胞学玻片由中国医学院肿瘤医 院细胞学专家采用 ＴＢＳ（ｔｈｅＢｅｔｈｅｓｄａＳｙｓｔｅｍ）分级 系统进行细胞学分级诊断，即无上皮内病变（Ｎｅｇａ－ ｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ， ＮＩＬＭ），意义未明确的非典型鳞状 上皮细胞增生 （ＡｔｙｐｉｃａｌＳｑｕａｒｎｏｕｓＣｅｌｌｓｏｆＵｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄＳｉｇｎｉｆ－ ｉｃａｎｃｅ，ＡＳＣ－ＵＳ），非 典 型 腺 上 皮 细 胞 （Ａｔｙｐｉｃａｌ ＧｌａｎｄｕｌａｒＣｅｌｌｓ，ＡＧＣ），非 典 型 鳞 状 细 胞 不 除 外 高 级鳞状上皮内病变（ＡｔｙｐｉｃａｌＳｑｕａｍｏｕｓＣｅｌｌｓ，Ｃａｎ－ ｎｏｔ Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｈｉｇｈ ＧｒａｄｅＩｎｔｍｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ， ＡＳＣ－Ｈ），低 级 别 鳞 状 上 皮 内 病 变 （Ｌｏｗ Ｇｒａｄｅ ＳｑｕａｍｏｕｓＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＬｅｓｉｏｎ，ＬＩＳＬ），高 级 别 鳞 状上皮内 病 变（ＨｉｇｈＧｒａｄｅＳｑｕａｍｏｕｓＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅ－ ｌｉａｌＬｅｓｉｏｎ，ＨＩＳＬ），鳞 状 细 胞 癌 （Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＳＣＣ）。 ４ ＨＰＶＤＮＡ检测 ４．１ 主要仪器与试剂 五通道荧光定量 ＰＣＲ检测系统（江苏中生方政 公司）、干式恒温器（江苏海门其林贝尔仪器公司）、 ＩｓｏｍｅｇａＨＰＶ 检 测 试 剂 盒 （江苏中生方政 公 司）； ＨＣ２检 测 系 统（ＤＭＬ２０００基因杂交信号放大仪、 旋涡振荡器、自动恒温加热仪）及 ＨＣ２检测试剂盒 （德国 ＱＩＡＧＥＮ 公 司）、水 浴 锅 （北 京 长 风 仪 器 公 司）；杂交炉（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公 司）、９６孔 ＰＣＲ 热 循环仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９７００）、Ａｕｔｏ－ＬｉＰＡ４８ 仪（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 （德国 ＱＩＡＧＥＮ 公 司）、ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ＨＰＶ 基 因 扩 增试剂盒（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）。 ４．２ Ｉｓｏｍｅｇａ检测 吸取１ｍｌ存放在细胞保存液中的样本于离心 管中，高速离心１０ｍｉｎ，再除 去 上 清 液，加 入１００ ! ｌ 裂解液，充分混匀。放入干式恒温器（中生方政）中 ９５℃加热１５ｍｉｎ。吸 取２μｌ处理好的样本加入反 应液中，加入阴、阳性质控。将反应管放置于五通道 荧光定量 ＰＣＲ检测系统（中生方政），设置恒温反应 程序：６０℃，７５ｍｉｎ，每分钟相当于一个循环。同 一 反应管中由检测仪器四种荧光检 测通道 （ＦＡＭ、 ＣＹ５、ＲＯＸ、ＶＩＣ），分 别 检 测 １３ 种 ＨＲ－ＨＰＶ、 ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及内参（人β血红蛋白基因），内参 用于评估样本质量及核酸扩增抑制因素。待检样本 在 ＦＡＭ、ＣＹ５、ＲＯＸ 荧光检测通道扩增过程中没有 明显呈指数增长的荧光信号，内参在 ＶＩＣ荧光检测 通道循环值≤６５ｍｉｎ，判断 为 阴 性；若 ＦＡＭ、ＣＹ５、 ＲＯＸ荧光检测通道循环值≤６５ｍｉｎ，内参在 ＶＩＣ荧 光检测通道扩增过程中有或没有明显呈指数增长的 荧光信 号，均 判 断 为 阳 性。检 测 阈 值 为 １０００ 拷 贝／ｍＬ。 ４．３ ＨＣ２检测 分别吸取５００! ｌ、１０００! ｌ含有指示剂的裂解液加 入阳性校准品和阴性校准品中，６５℃水浴４５ｍｉｎ进 行裂解。吸取７５μｌ裂解好的待测标本和阴、阳性对 照加入微孔板中，每孔再加入２５μｌ配好的高危型探 针工作液，６５℃孵育１ｈ。将各孔液体转移至捕获孔 中，振荡１ｈ，弃掉液体。每孔加入７５μｌ的０．０５％叠 氮化钠缓冲溶液和碱性磷酸酶结合抗体，２０℃～２５℃ 放置０．５ｈ，弃掉液体，用洗液用力冲洗各孔６次，反 转放置５ｍｉｎ。每孔加入７５μｌ荧光底物，置于 ＤＭＬ ４期 王林，等．恒温扩增 ＨＰＶ 检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究 · ９９４ ·
2000基因杂交信号放大仪( QIAGEN)内,20℃~学诊断结果为≥ ASC-US的受试者召回,进行阴道 25℃避光保持15min,设置程序,读取数值,相对光强镜检查。若阴道镜下有可见病变,则在病变处直接 度值等于或大于临界值时(即RLU/CO≥0)的样本取活检,若无可见病变,则取宫颈多点活检或ECC 判定为阳性,RIU/CO<10判定为阴性。HC2的检活检标本由中国医学科学院肿瘤医院病理学专家依 测阈值为5000拷贝/mL 据世界卫生组织(WHO)子宫颈肿瘤组织学诊断标 44 INNO-LIPA分型检测 准进行盲法诊断,诊断结果为正常、轻、中、重度宫颈 对 Iomega检测为HPV16和(或)HPV18阳性上皮内瘤变(CIN1、CIN2、CIN3)和宫颈癌 的标本以及其他 HR-HPV与HC2检测结果不一致6统计学分析 标本,采用 INNO-LIPA进行分型检测。采用离心柱 采用 Excel2016进行数据库管理,SPSS180 法提取宫颈脱落细胞DNA( QIAamp96DNA提取试软件进行统计学分析。计算总一致率,阳性一致率 剂盒,德国 QIAGEN公司);吸取10提取好的阴性一致率和 Kappa值用于评估两种检测方法的 DNA加入事先配好试剂的96孔PCR板孔中,每板致程度。计算灵敏度和特异度用于评估检测方法 PCR加入两个阳性对照(10HPV6型质粒)和两个用于宫颈癌前病变CIN2+有效性。两种检测之间 阴性性对照(10 uI DEPC水)。PCR程序设定为40个灵敏度或特异度的比较采用x2检验,检验水准 循环扩增(94℃30s,25℃52s,72℃45s)。将扩增a=0.05。 产物与固定在薄膜检测条带上的28种特异性寡核苷 酸探针杂交,通过洗液清除杂质,使用酶促反应使条 结果 带上结合扩增产物的区域显色。 INNO-LiPA检测完 成后,将所有条带黏贴到 INNO-LiPA扫描判读摸版1液基细胞学诊断结果 上,使用扫描仪进行条带分析。该技术可以检测28 2774例研究对象全部完成相关检测,结果纳 种HPV型别,包括HPV6、HPV1l、HPV16、HPV18、入统计学分析。细胞学诊断结果NILM2322例, HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、ASC-US272例,AGC11例,ASC-H15例,LISL HPⅤ43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53 115例,HISL37例,SCC2例。452例细胞学异常 HPV54、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、(ASC-US及以上)的标本中两种检测方法检出 HPV69、HPV70、HPV71、HPV73、HPV74 HR-HPV均为211例,阳性率4668%,并且,随着 和HPV82。 细胞学分级的增加, Iomega和HC2两种检测方法 5阴道镜检查及活检 检出HR-HPV阳性率均有升高的趋势(P<Q001) 检测结果为HPV16/HPV18任意阳性或细胞(表1)。 表1HPⅤ检测结果与细胞学诊断的关系 Table 1 Relationship between HPV test results and cytological diagnosis Iomega LBC Total HR-HPV HPV16 HPV18 her HR-HPv NILM 297(1279) 20( 243(1047) 5(883) ASC-US 272(9.80) 76(27.94) AGC 11(040) 4(3636) 0(0 4(3636) 4(3636 ASC-H 10(6667) 2(1333) 4(26.67) 13(86.67) LISI 115(415) 87(75.76) 22(19.13) 4(348) 64(55.65 96(83.48) HISI 32(86 19(51.53) 4(10.81) 10(27.03) 2(0.02) 2(100.00) 0(0.00) 0(0.00) 2(10000) 2L.57 5.65 1328 P <0001 0.001 <0001 <0001 Total 2774 8(1831) 101(364) 33(L19 387(1395) 416(1500) 注:a. Iomega可检测的除HPV16/HPV18以外其他13种HPV型别;LBC,液基细胞学;()内为% Notes: a. Other 13 HPV genotypes except HPV16/HPV18 that Isomega can detect: LBC, liquidbased cytology :() 2HPⅤ检测结果比较 9272% Kappa=0.74(95%Cl=0.71~0.77),阳 Iomega和HC2检出HPV总的一致率为性的一致率为8678%,阴性的一致率为9377% 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
２０００基 因 杂 交 信 号 放 大 仪 （ＱＩＡＧＥＮ）内，２０℃ ～ ２５℃避光保持１５ｍｉｎ，设置程序，读取数值，相对光强 度值等于或大于临界值时（即 ＲＬＵ／ＣＯ≥１．０）的样本 判定为阳性，ＲＬＵ／ＣＯ＜１．０判定为阴性。ＨＣ２的检 测阈值为５０００拷贝／ｍＬ。 ４．４ ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ分型检测 对Ｉｓｏｍｅｇａ检测为 ＨＰＶ１６和（或）ＨＰＶ１８阳 性 的标本以及其他 ＨＲ－ＨＰＶ 与 ＨＣ２检测结果不一致 标本，采用ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ进行分型检测。采用离心柱 法提取宫颈脱落细胞 ＤＮＡ（ＱＩＡａｍｐ９６ＤＮＡ 提取试 剂盒，德 国 ＱＩＡＧＥＮ 公 司）；吸 取 １０μｌ提 取 好 的 ＤＮＡ加入事先配好试剂的９６孔 ＰＣＲ 板孔中，每板 ＰＣＲ加入两个阳性对照（１０μｌＨＰＶ６型质粒）和两个 阴性性对照（１０μｌＤＥＰＣ水）。ＰＣＲ程序设定为４０个 循环扩增（９４℃ ３０ｓ，２５℃ ５２ｓ，７２℃ ４５ｓ）。将扩增 产物与固定在薄膜检测条带上的２８种特异性寡核苷 酸探针杂交，通过洗液清除杂质，使用酶促反应使条 带上结合扩增产物的区域显色。ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 检测完 成后，将所有条带黏贴到ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 扫描判读摸版 上，使用扫描仪进行条带分析。该技术可以检测２８ 种 ＨＰＶ 型别，包括 ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ７３、 ＨＰＶ７４ 和 ＨＰＶ８２。 ５ 阴道镜检查及活检 检测结果 为 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８任意阳性或细胞 学诊断结果为≥ＡＳＣ－ＵＳ的 受 试 者 召 回，进 行 阴 道 镜检查。若阴道镜下有可见病变，则在病变处直接 取活检，若无可见病变，则取宫颈多点活检或 ＥＣＣ。 活检标本由中国医学科学院肿瘤医院病理学专家依 据世界卫生组织（ＷＨＯ）子宫颈肿瘤组织学诊断标 准进行盲法诊断，诊断结果为正常、轻、中、重度宫颈 上皮内瘤变（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３）和宫颈癌。 ６ 统计学分析 采用 Ｅｘｃｅｌ２０１６ 进 行 数 据 库 管 理，ＳＰＳＳ１８．０ 软件进行统计学分析。计算总一致率，阳性一致率， 阴性一致率 和 Ｋａｐｐａ值用于评估两种检测方法的 一致程度。计算灵敏度和特异度用于评估检测方法 用于宫颈癌前病变 ＣＩＮ２＋有效性。两种检测之间 灵敏度或特异度 的比较采用 χ ２ 检 验，检 验 水 准 α＝０．０５。 结 果 １ 液基细胞学诊断结果 ２７７４例研 究 对 象 全 部 完 成 相 关 检 测，结 果 纳 入统计学分 析。细 胞 学 诊 断 结 果 ＮＩＬＭ ２３２２例， ＡＳＣ－ＵＳ２７２ 例，ＡＧＣ１１ 例，ＡＳＣ－Ｈ １５ 例，ＬＩＳＬ １１５例，ＨＩＳＬ３７例，ＳＣＣ２例。４５２例细 胞 学 异 常 （ＡＳＣ－ＵＳ 及 以 上）的标本中两种检 测方法检出 ＨＲ－ＨＰＶ 均为２１１例，阳性率４６．６８％，并且，随着 细胞学分级的增加，Ｉｓｏｍｅｇａ和 ＨＣ２两种检测方法 检出 ＨＲ－ＨＰＶ 阳性率均有升高的趋势（Ｐ＜０．００１） （表１）。 表１ ＨＰＶ检测结果与细胞学诊断的关系 Ｔａｂｌｅ１ ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＨＰＶｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ ＬＢＣ Ｔｏｔａｌ Ｉｓｏｍｅｇａ ＨＲ－ＨＰＶ ＨＰＶ１６ ＨＰＶ１８ ｏｔｈｅｒＨＲ－ＨＰＶａ ＨＣ２ ＮＩＬＭ ２３２２（８３．１７） ２９７（１２．７９） ４０（１．７２） ２０（０．８６） ２４３（１０．４７） ２０５（８．８３） ＡＳＣ－ＵＳ ２７２（９．８０） ７６（２７．９４） １１（４．０４） ３（１．１０） ６２（２２．７９） ６１（２２．４３） ＡＧＣ １１（０．４０） ４（３６．３６） ０（０．００） ０（０．００） ４（３６．３６） ４（３６．３６） ＡＳＣ－Ｈ １５（０．５４） １０（６６．６７） ７（４６．６７） ２（１３．３３） ４（２６．６７） １３（８６．６７） ＬＩＳＬ １１５（４．１５） ８７（７５．７６） ２２（１９．１３） ４（３．４８） ６４（５５．６５） ９６（８３．４８） ＨＩＳＬ ３７（１．３３） ３２（８６．４９） １９（５１．５３） ４（１０．８１） １０（２７．０３） ３５（９４．５９） ＳＣＣ ２（０．０２） ２（１００．００） ２（１００．００） ０（０．００） ０（０．００） ２（１００．００） Ｚ — ２１．５７ １８．８１ ５．６５ １３．２８ ２７．４０ Ｐ — ＜０．００１ ＜０．００１ ＜０．００１ ＜０．００１ ＜０．００１ Ｔｏｔａｌ ２７７４ ５０８（１８．３１） １０１（３．６４） ３３（１．１９） ３８７（１３．９５） ４１６（１５．００） 注：ａ．Ｉｓｏｍｅｇａ可检测的除 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８以外其他１３种 ＨＰＶ 型别；ＬＢＣ，液基细胞学；（）内为％。 Ｎｏｔｅｓ：ａ．Ｏｔｈｅｒ１３ＨＰＶｇｅｎｏｔｙｐｅｓｅｘｃｅｐｔＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８ｔｈａｔＩｓｏｍｅｇａｃａｎｄｅｔｅｃｔ；ＬＢＣ，ｌｉｑｕｉｄ－ｂａｓｅｄｃｙｔｏｌｏｇｙ；（）％． ２ ＨＰＶ检测结果比较 Ｉｓｏｍｅｇａ和 ＨＣ２ 检 出 ＨＰＶ 总 的 一 致 率 为 ９２．７２％，Ｋａｐｐａ＝０．７４（９５％ＣＩ＝０．７１～０．７７），阳 性的一致 率 为 ８６．７８％，阴性的一致率为 ９３．７７％ · ００５ · 病 毒 学 报 ３４卷
王林,等.恒温扩増HPⅤ检测技术应用于子宫颈癌筛査的效果评价硏究 501 (表2)。321例 Iomega检测为HPV16/HPV18阳 表3 INNO-LiPA分型结果 性的标本和两种方法检测不一致的标本做了IN- Table 3 Result for INNO-LiPA NO-LPA分型检测,结果中部分标本存在多重感 Iomega positive Iomega Negative 染,其中99例为HPV16阳性,36例为HPV18阳 HPV type HC2 Negative HC2 Positive (n=147) 性,179例为其他型别阳性,64例为“未检测到 INNO-LiPA Positive 82(5678 40(7273) HPV”既不在其检测范围内,17例为阴性,为便于 13 HR-HPV b 65(4422) 26(47.27) 分析,将结果为“未检测到HPV”的标本归于阴性 INNO-LiPA Negative 65(44. 22) 15(27.27) 当中。以 INNO-LIPA结果为标准, Iomega检测 HPV16的准确率为96.97%(96/99),检测 020 HPV18的准确率为86.11%(31/36)。对两种检 测方法检测结果不一致的标本分析(不包含 Isome检测结果HPV16/HPV18和两种方法同时 阳性的标本),147例 Iomega检测结果阳性且 HC2阴性的标本中, INNO-LIPA检测HPV阳性 为82例,其中HC2可检测的13种HR-HPV阳性 为65例, Iomega可检测的15种HR-HPV为74 例;55例 Iomega检测结果阴性且HC2阳性的标 本中, INNO-LiPA检测HPⅤ阳性为40例,其中 10 Iomega可检测的15种 HR-HPV型别为28例 HC2可检测的13种HR-HPV阳性为26例。两 863353345523568968 00.35422 种方法检测结果不一致标本的 INNO-LiPA分型 结果见表3。 213 表2 Iomega与HC2检测HPⅤ结果 Table 2 Results for Isomega and HC2 Iomega Total 注:a.仅包含 Iomega与HC2检测结果不一致标本,b.针对 HC2可检测的13种高危HPV型别;c.针对 I omega HPv可检测 2211 2266 的15种高危HPV型别; d INNO-LiPA无法具体区分HPV69和 Total 2358 2774 HPV71型别;()内为% 3两种HPⅤ检测技术用于宫颈癌及癌前病变的筛cd15 HPV genotypes that Iomega can detect: e,. INNO-LiPA 查能力比较 nnot distinguish between HPV69 and HPV71:()% 本研究人群中CIN1患者31例,CIN2患者27 表4 Iomega和H2检测结果与病理诊断的关系 例,CIN3患者20例,宫颈癌患者2例。 Iomega检 Table 4 Relationship between HPV test results 出CIN2+的灵敏度为87.76%(95%CI:7576% and the pathological diagnosis 9427%),特异度为8294%(95%CI:81.48%~ ological status Total 8430%),阳性预测值为847%(95%CI:635%~ Tests <CINZ 11.21%),阴性预测值为99.74%(95%CI:99.42% Positive 99.88%);HC2灵敏度和特异度分别为100.00% 2260 2266 (95%CI:9273%~10000%)和8653%(95%CI 8520%~87.76%),阳性预测值为1178%(95% 416 CI:9.02%~1523%),阴性预测值为100%(95% 2358 CI:99.84%~10000%)(表4)。 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
（表２）。３２１例Ｉｓｏｍｅｇａ检测为 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８阳 性 的 标 本 和 两 种 方 法 检 测 不 一 致 的 标 本 做 了ＩＮ－ ＮＯ－ＬｉＰＡ 分型 检 测，结 果 中 部 分 标 本 存 在 多 重 感 染，其中９９例 为 ＨＰＶ１６阳 性，３６例 为 ＨＰＶ１８阳 性，１７９ 例 为 其 他 型 别 阳 性，６４ 例 为 “未 检 测 到 ＨＰＶ”既不在其 检 测 范 围 内，１７例 为 阴 性，为 便 于 分析，将结果为“未 检 测 到 ＨＰＶ”的标本归于阴性 当中。以ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 结 果 为 标 准，Ｉｓｏｍｅｇａ检 测 ＨＰＶ１６ 的 准 确 率 为 ９６．９７％ （９６／９９），检 测 ＨＰＶ１８的 准 确 率 为 ８６．１１％（３１／３６）。对 两 种 检 测方 法 检 测 结 果 不 一 致 的 标 本 分 析 （不 包 含 Ｉｓｏｍｅｇ检测结果 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８和两种方法同时 阳 性 的 标 本），１４７ 例 Ｉｓｏｍｅｇａ检 测 结 果 阳 性 且 ＨＣ２阴 性 的 标 本 中，ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 检 测 ＨＰＶ 阳 性 为８２例，其中 ＨＣ２可检测的１３种 ＨＲ－ＨＰＶ 阳性 为６５例，Ｉｓｏｍｅｇａ可 检 测 的 １５ 种 ＨＲ－ＨＰＶ 为 ７４ 例；５５例Ｉｓｏｍｅｇａ检 测 结 果 阴 性 且 ＨＣ２阳 性 的 标 本 中，ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 检 测 ＨＰＶ 阳 性 为 ４０ 例，其 中 Ｉｓｏｍｅｇａ可 检 测 的 １５ 种 ＨＲ－ＨＰＶ 型 别 为 ２８ 例， ＨＣ２可 检 测 的 １３ 种 ＨＲ－ＨＰＶ 阳 性 为 ２６ 例。两 种方法 检 测 结 果 不 一 致 标 本 的ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 分 型 结果见表３。 表２ Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２检测 ＨＰＶ结果 Ｔａｂｌｅ２ ＲｅｓｕｌｔｓｆｏｒＩｓｏｍｅｇａａｎｄＨＣ２ Ｉｓｏｍｅｇａ ＨＣ２ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔｏｔａｌ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ３６１ １４７ ５０８ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ５５ ２２１１ ２２６６ Ｔｏｔａｌ ４１６ ２３５８ ２７７４ ３ 两种 ＨＰＶ检测技术用于宫颈癌及癌前病变的筛 查能力比较 本研究人群中 ＣＩＮ１患者３１例，ＣＩＮ２患者２７ 例，ＣＩＮ３患者２０例，宫颈癌患者２例。Ｉｓｏｍｅｇａ检 出 ＣＩＮ２＋的灵敏度为８７．７６％（９５％ＣＩ：７５．７６％～ ９４．２７％），特 异 度 为 ８２．９４％ （９５％ＣＩ：８１．４８％ ～ ８４．３０％），阳性预测值为８．４７％（９５％ＣＩ：６．３５％～ １１．２１％），阴性预测值为９９．７４％（９５％ＣＩ：９９．４２％ ～９９．８８％）；ＨＣ２灵敏度和特异度分别为１００．００％ （９５％ＣＩ：９２．７３％～１００．００％）和８６．５３％（９５％ＣＩ： ８５．２０％～８７．７６％），阳 性 预 测 值 为 １１．７８％（９５％ ＣＩ：９．０２％～１５．２３％），阴 性 预 测 值 为 １００％（９５％ ＣＩ：９９．８４％～１００．００％）（表４）。 表３ ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ分型结果ａ Ｔａｂｌｅ３ ＲｅｓｕｌｔｆｏｒＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ＨＰＶｔｙｐｅ ＩｓｏｍｅｇａＰｏｓｉｔｉｖｅ， ＨＣ２Ｎｅｇａｔｉｖｅ （ｎ＝１４７） ＩｓｏｍｅｇａＮｅｇａｔｉｖｅ， ＨＣ２Ｐｏｓｉｔｉｖｅ （ｎ＝５５） ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡＰｏｓｉｔｉｖｅ ８２（５６．７８） ４０（７２．７３） １３ＨＲ－ＨＰＶｂ ６５（４４．２２） ２６（４７．２７） １５ＨＲ－ＨＰＶｃ ７４（５０．４３） ２８（５０．９１） ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ６５（４４．２２） １５（２７．２７） １１ １ ０ １６ １２ ２ １８ ３ ０ ２６ １ ０ ３１ ５ ０ ３３ ２ ０ ３５ ３ ０ ３９ １６ １ ４３ ２ ０ ４４ １ １ ４５ ２ ０ ５１ ８ ０ ５２ ２５ １９ ５３ １０ ３ ５４ １０ ５ ５６ ５ ４ ５８ ７ ２ ５９ １ ２ ６６ ５ ２ ６８ ８ １ ６９／７１ｄ ３ ３ ７０ ３ ０ ７４ ５ ４ ８２ ０ ５ 注：ａ．仅 包 含Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２ 检测结果不一致标本。ｂ．针 对 ＨＣ２可检测的１３种高危 ＨＰＶ 型别；ｃ．针对ＩｓｏｍｅｇａＨＰＶ 可 检 测 的１５种 高 危 ＨＰＶ 型 别；ｄ．ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 无 法 具 体 区 分 ＨＰＶ６９ 和 ＨＰＶ７１型别；（）内为％。 Ｎｏｔｅｓ：ａ，ｉｎｃｌｕｄｅｓｏｎｌｙｔｈｅｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｂｙＩｓｏｍｅｇａａｎｄ ＨＣ２；ｂ，ｉｎｃｌｕｄｅｓ１３ ＨＰＶｇｅｎｏｔｙｐｅｓｔｈａｔＨＣ２ｃａｎｄｅｔｅｃｔ；ｃ，ｉｎ－ ｃｌｕｄｅｓ１５ＨＰＶｇｅｎｏｔｙｐｅｓｔｈａｔＩｓｏｍｅｇａｃａｎｄｅｔｅｃｔ；ｅ，ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ｃａｎｎｏｔｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｂｅｔｗｅｅｎＨＰＶ６９ａｎｄＨＰＶ７１；（）％ 表４ Ｉｓｏｍｅｇａ和 ＨＣ２检测结果与病理诊断的关系 Ｔａｂｌｅ４ ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＨＰＶｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｔｅｓｔｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｔｕｓ ≥ＣＩＮ２ ＜ＣＩＮ２ Ｔｏｔａｌ Ｉｓｏｍｅｇａ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ４３ ４６５ ５０８ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ６ ２２６０ ２２６６ Ｔｏｔａｌ ４９ ２７２５ ２７７４ ＨＣ２ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ４９ ３６７ ４１６ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ０ ２３５８ ２３５８ Ｔｏｔａｌ ４９ ２７２５ ２７７４ ４期 王林，等．恒温扩增 ＨＰＶ 检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究 · １０５ ·
可能是由于某些HPV型别在进化基因组学中属于 讨论 同一条进化分支,其遗传物质具有相似之处,如: HPV70与HPV18,HPV53、HPV66与HPV51 1995年举办的国际癌症研究机构(IARC)专题HPV26、HPV82与HPV56属于同一进化分支;其 讨论会认为,宫颈癌本质上是一种感染性疾病,主要次探针的错配也可能造成交叉反应[4:1。除此之 病因是HR-HPⅤ感染。 HR-HPV DNA检测是直外,HC2由于无法区分HPV16和HPV18,而且没 接针对病因的检查,可将感染HR-HPV的妇女筛有内参监控取样的质量,并且操作复杂、耗时长、价 选出来,能够早期发现并清除宫颈病变,降低发病风格较高,在一定程度上对其使用受到限制。 险,比治疗宫颈癌患者成本效益更高。2005年 本次研究结果显示, Iomega与HC2检测HR WHO发表声明: HPV DNA检测可作为宫颈癌的HPV具有较高的一致率;根据 INNO-LiPA分型结 初筛手段。在众多HPⅤ型别中,HPV16和18果显示 Iomega检出HPV16的准确率均较高为 是引起宫颈癌最常见的型别,我国一项调查显示,在9697%(96/99),而检出HPV18的准确率相对较 近77%的宫颈鳞癌中可检测出HPV16,8%可检测低,为8611%(31/36),未检出HPV18的5例标本 出HPV18,而其他12种高危型别仅占10%左均为HPV16阳性,经分析其原因可能是由于 右。目前,我国临床宫颈癌筛查指南规定,对30HP16浓度较高,从而抑制HPV18的检测。此 ~64岁妇女HPⅤ检测结果为16/18型别任意阳性外,根据INNO-LPA分型结果发现,两种检测技术 的病人需转诊阴道镜,而其他HRHPⅤ感染只需均存在交叉反应现象,在202例两种检测结果不 要定期复查。因此,理想的宫颈癌筛查技术不但需致的标本的分型结果中,除去检测结果为“ HPV not 要满足操作简便,价格合适,同时还可以单独提供 detected”的标本,HC2检测结果19例为假阳性,其 HPV16/HPV18型别信息和其他12种高危型别检中6例为真阴性,产生交叉反应的型别为HPV53 测结果,此外还需要提供内参的检测信息,用来评价HPV54、HPV69/HPV71和HPV82与其他研究相 所取样本的质量,这对门诊病人的分流和宫颈癌筛似[1; Iomega检测结果18例为假阳性,其中12例 查效率的提高将会有很大帮助。 为真阴性,产生交叉反应的型别为HPV11 目前检测HR-HPV的方法主要有以PCR为基HPV26、HPV43、HPV54和HPV70。除此之外 础的HPⅤ检测技术、杂交捕获方法(如HC2)和飞HC2漏检65例HR-HPV,其中主要包括25例 行质谱法,其中以PCR为基础的HPⅤ分型检测技HPV52、16例HPV39、12例HPV16和3例 术可达到上述的理想模式,且具有较高的敏感性,在HPV18,漏检率为3218%(65/202);而 Iomega漏 临床上和实验室中应用广泛。然而,PCR技术需要检28例 HR-HPV,其中主要包括19例HPV52、2 反复的热变性,无法摆脱对精良昂贵的仪器设备的例HPV16、无HPV18,漏检率为1368%(28/ 依赖,操作过程中容易污染,而且扩增反应时间长,202)。所以从本研究结果上看在 HR-HPV检测方 一般需要几个小时[2。恒温DNA扩增技术是一门面 Iomega检测更为准确,但是两种检测方法对 新型的体外核酸扩增技术,具有恒温、高效、特异,不HPV52的漏检率均较高,其原因目前尚不明确,还 需要特殊、昂贵的仪器设备等优势,在生命科学硏究需要进一步研究探讨。另外,根据分型结果,Iso 及相关诸多领域应用日益广泛。 Iomega是基于恒mega检测技术判定阳性界值的范围为47~48,但 温DNA扩增原理的HPⅤ检测技术,将DNA提取是该技术最佳阴、阳性循环界值还需要大样本研究 和扩增一体化,可特异性区分HPV16和18两种来进一步优化确定。 型别, 本研究结果显示,HC2检测CIN2+的灵敏度 HC2为首个获得美国食品药品监督管理局批为10000%,特异度为86.53%。与其他文献报道 准用于临床的 HPV DNA检测技术13。HC2在宫的HC2针对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度和特 颈癌筛查中具有很高的灵敏度和特异度,同时也常异度分别为95%和85%有差异16。根据INNO 被作为标准对照与其他HPⅤDNA检测方法对比。LiPA分型结果显示,2例病理诊断结果为CIN2的 但是,相关研究证实HC2对HPV11、HPV53、标本为低危HPⅤ感染(一例为HPV82,另一例为 HPV62、HPV66、HPV67、HPV70、HPV82和HPV54混合感染),年龄为35岁和37 HPVT1、HPV81、HPV82型具有交叉反应,其原因岁,其原因可能是这两例患者正处于宫颈癌前病变 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
讨 论 １９９５年举办的国际癌症研究机构（ＩＡＲＣ）专题 讨论会认为，宫颈癌本质上是一种感染性疾病，主要 病因是 ＨＲ－ＨＰＶ 感染。ＨＲ－ＨＰＶ ＤＮＡ 检测是直 接针对病因 的 检 查，可 将 感 染 ＨＲ－ＨＰＶ 的 妇 女 筛 选出来，能够早期发现并清除宫颈病变，降低发病风 险，比治 疗 宫 颈 癌 患 者 成 本 效 益 更 高［９］。２００５ 年 ＷＨＯ 发表声明：ＨＰＶ ＤＮＡ 检测可作为宫颈癌的 初筛手 段［１０］。在 众 多 ＨＰＶ 型 别 中，ＨＰＶ１６ 和 １８ 是引起宫颈癌最常见的型别，我国一项调查显示，在 近７７％的宫颈鳞癌中可检测出 ＨＰＶ１６，８％可检测 出 ＨＰＶ１８，而 其 他 １２ 种 高 危 型 别 仅 占 １０％ 左 右［１１］。目前，我国临床宫颈癌筛查指南规定，对３０ ～６４岁妇女 ＨＰＶ 检测结果为１６／１８型别任意阳性 的病人需转 诊 阴 道 镜，而 其 他 ＨＲ－ＨＰＶ 感 染 只 需 要定期复查。因此，理想的宫颈癌筛查技术不但需 要满足操作 简 便，价 格 合 适，同时还可以单独提供 ＨＰＶ１６／ＨＰＶ１８型别信息和其他１２种高危型别检 测结果，此外还需要提供内参的检测信息，用来评价 所取样本的质量，这对门诊病人的分流和宫颈癌筛 查效率的提高将会有很大帮助。 目前检测 ＨＲ－ＨＰＶ 的方法主要有以ＰＣＲ为基 础的 ＨＰＶ 检测技术、杂交捕获方法（如 ＨＣ２）和飞 行质谱法，其中以 ＰＣＲ 为基础的 ＨＰＶ 分型检测技 术可达到上述的理想模式，且具有较高的敏感性，在 临床上和实验室中应用广泛。然而，ＰＣＲ 技术需要 反复的热变性，无法摆脱对精良昂贵的仪器设备的 依赖，操作过程中容易污染，而且扩增反应时间长， 一般需要几个小时［１２］。恒温 ＤＮＡ 扩增技术是一门 新型的体外核酸扩增技术，具有恒温、高效、特异，不 需要特殊、昂贵的仪器设备等优势，在生命科学研究 及相关诸多领域应用日益广泛。Ｉｓｏｍｅｇａ是基于恒 温 ＤＮＡ 扩增原理的 ＨＰＶ 检测技术，将 ＤＮＡ 提取 和扩增 一 体 化，可 特 异 性 区 分 ＨＰＶ１６ 和 １８ 两 种 型别。 ＨＣ２为首个获得美国食品药品监督管理局批 准用于临床的 ＨＰＶＤＮＡ 检测技术［１３］。ＨＣ２在宫 颈癌筛查中具有很高的灵敏度和特异度，同时也常 被作为标准对照与其他 ＨＰＶ ＤＮＡ 检测方法对比。 但 是，相 关 研 究 证 实 ＨＣ２ 对 ＨＰＶ１１、ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ７１、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８２型 具 有 交 叉 反 应，其 原 因 可能是由于某些 ＨＰＶ 型别在进化基因组学中属于 同一 条 进 化 分 支，其遗传物质具有相似之处，如： ＨＰＶ７０ 与 ＨＰＶ１８，ＨＰＶ５３、ＨＰＶ６６ 与 ＨＰＶ５１， ＨＰＶ２６、ＨＰＶ８２与 ＨＰＶ５６属于同一进化分 支；其 次探针的 错 配 也 可 能 造 成 交 叉 反 应［１４，１５］。除 此 之 外，ＨＣ２由于无法区分 ＨＰＶ１６和 ＨＰＶ１８，而 且 没 有内参监控取样的质量，并且操作复杂、耗时长、价 格较高，在一定程度上对其使用受到限制。 本次研究结果显示，Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２检测 ＨＲ－ ＨＰＶ 具有较高的一致率；根据ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 分型结 果显示Ｉｓｏｍｅｇａ检 出 ＨＰＶ１６ 的 准 确 率 均 较 高 为， ９６．９７％（９６／９９），而 检 出 ＨＰＶ１８ 的 准 确 率 相 对 较 低，为８６．１１％（３１／３６），未检出 ＨＰＶ１８的５例标本 均为 ＨＰＶ１６ 阳 性，经 分 析 其 原 因 可 能 是 由 于 ＨＰＶ１６浓 度 较 高，从 而 抑 制 ＨＰＶ１８ 的 检 测。此 外，根据ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 分型结果发现，两种检测技术 均存在交叉反应现象，在２０２例两种检测结果不一 致的标本的分型结果中，除去检测结果为“ＨＰＶｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ”的标本，ＨＣ２检测结果１９例为假阳性，其 中６例为真阴性，产生交叉反应的 型 别 为 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５４、ＨＰＶ６９／ＨＰＶ７１和 ＨＰＶ８２与其 他 研 究 相 似［１３］；Ｉｓｏｍｅｇａ检测结果１８例为假阳性，其中１２例 为 真 阴 性，产生交叉反应的型别为 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ２６、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ５４ 和 ＨＰＶ７０。除 此 之 外， ＨＣ２漏 检 ６５ 例 ＨＲ－ＨＰＶ，其 中 主 要 包 括 ２５ 例 ＨＰＶ５２、１６ 例 ＨＰＶ３９、１２ 例 ＨＰＶ１６ 和 ３ 例 ＨＰＶ１８，漏检率为３２．１８％（６５／２０２）；而Ｉｓｏｍｅｇａ漏 检２８例 ＨＲ－ＨＰＶ，其 中 主 要 包 括１９例 ＨＰＶ５２、２ 例 ＨＰＶ１６、无 ＨＰＶ１８，漏 检 率 为 １３．６８％ （２８／ ２０２）。所以从本研究结果上看在 ＨＲ－ＨＰＶ 检测方 面Ｉｓｏｍｅｇａ检 测 更 为 准 确，但 是 两 种 检 测 方 法 对 ＨＰＶ５２的漏检率均较高，其原因目前尚 不 明 确，还 需要进 一 步 研 究 探 讨。另 外，根 据 分 型 结 果，Ｉｓｏ－ ｍｅｇａ检测技术判定阳性界值的范围 为４７～４８，但 是该技术最佳阴、阳性循环界值还需要大样本研究 来进一步优化确定。 本研究 结 果 显 示，ＨＣ２检 测 ＣＩＮ２＋的 灵 敏 度 为１００．００％，特异度为８６．５３％。与其他文献 报 道 的 ＨＣ２针对宫颈癌及癌前病变的筛查灵敏度和特 异度分 别 为 ９５％ 和 ８５％ 有 差 异［１６］。根 据ＩＮＮＯ－ ＬｉＰＡ 分型结果显示，２例病理诊断结果为 ＣＩＮ２的 标本为 低 危 ＨＰＶ 感 染（一 例 为 ＨＰＶ８２，另 一 例 为 ＨＰＶ８２和 ＨＰＶ５４混 合 感 染），年 龄 为 ３５ 岁 和 ３７ 岁，其原因可能是这两例患者正处于宫颈癌前病变 · ２０５ · 病 毒 学 报 ３４卷
王林,等·恒温扩增HPⅤ检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究503 的转归过程,其感染的HR-HPⅤ已经被机体清除 areon SC. Qiao Y L, Lerma E. Garland S M. Sasagawa 由于HC2发生交叉反应导致检测结果呈假阳性,故 T, Ferrera A, Hammouda D, Mariani L, Pelayo A 其灵敏度为10000%。在本研究中, Iomega检出 Steiner 1. Oliva E, Meijer C]. AHJassar W F, Cruz E CIN2+的灵敏度为87.76%,与HC2之间有统计学 Wright T C, Puras A, Llave C L, Tzardi M, Agorastos 差异(P=0.031),除去两例HC2假阳性结果的标 T, Garcia-Barriola V, Clavel C, Ordi J, Andujar M 本, Iomega和HC2的灵敏度分别为9149%和 Castellsague x, SanchezG I, Nowakowski A M. Borr stein J, Munoz N. Bosch FX, Retrospective Internatio- 10000%,差异无统计学意义(P=0125)。 al Survey and HPV Time Trends Study Group. Human 综上所述, Iomega HPV检测技术是一种应用 papillomavirus genotype attribution in invasive cervical 于宫颈癌筛查的新技术,可以有效地检测HR-HPV cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study DNA,并对高致癌风险的HPV16和HPV18进行 []. Lancet Oncol,2010,1l(11):10481056 单独分型检测,提高了筛查针对性,可使临床医生更[7] Rijkaard D C, Berkhof J, van Kemenade F J, Coupe V 好地指导和管理患者。 Iomega具有较高的灵敏度 M, Rozendaal L, Heideman D A, Verheijen R H, Bulk 和特异度,适用于医院和大范围的宫颈癌筛查使用, S, Verweij W, Snijders P J, Meijer C J. HPV DNA 具有很好的应用前景 testing in population-based cervical screening VUSA- reen study): results and implications[J]. Br J Canc- 参考文献 [1]乔友林.中国妇女人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌的流行 [8]Kleter 病学研究现状及其疫苗预防前景[J].中华流行病学杂 trowijoto S, ter Schegget J, Lindeman J, ter Harmsel 志,2007,28(10) B, Burger M, Quint W. Development and clinical evalur- [2] Martin C M, OLeary JJ. Histology of cervical intraepi- ation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line thelial neoplasia and the role of biomarkers [J]. Bes probe assay for detection and identification of anogenital Practice&. Research, 2011, 25(5):605-615 an papillomavirus [J]. J Clin Microbiol. 1999. 37 [3] Vidal A C, Smith J S, Valea F, Bentley R,Gradison (8).2508-2517 M, Yarnall s, Ford A, Overcash F, Grant K,Mur[9]乔友林,李静.子宫颈癌筛查方法新进展[J医学研究 phy SK. Hoyo C. HPV genotypes and cervical intraepi- 杂志,2009,38 thelial neoplasia in a multiethnic cohort in the southeast [10] Zhao F H, Lin M J, Chen F, Hu S Y, Zhang R,Be- ern USA [J]. Cancer Causes Control, 2014, 25(8) linson J L, Sellors J W, franceschi S, Qiao Y L, Cas- 1055-1062 tle p e, Cervical Cancer Screening Group in China, Per- [4] Petry K U, Menton S, Menton M, van Loenen-Frosch formance of highrisk human papillomavirus DNA tes- F, de Carvalho Gomes H B, Schopp B, gar brecht-Buettner S. Davies P, Boehmer G, van den ak- nalysis of individual patient data from 17 population ker E. Iftner T. Inclusion of HPv testing in routine based studies from China[J]. Lancet Oncol, 2010.11 ning for women above 29 years in get (12):1160-117 many: results for 8466 patients[J]. Br J Cancer,, 2003, [11 Chen W, Zhang X, Molijn A. Jenkins D, Shi J F. 88(10):1570-15 Quint W, chmidt J E, Wang P, Liu Y L, Li L K, Shi [5] Bosch F X, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJ, Shah K H, Liu J H. Xie X, Niyazi M, Yang P, Wei L H, Li V. The causal relation between human papillomavirus LY, Li J, Liu J F, Zhou Q, Hong Y, Li L, Li Q and cervical cancer [J]. J Clin Pathol, 2002, 55(4): Zhou H L, Bian M L, Chen J, Qiao Y L, Smith J S 244-265 papillomavirus [6] de Sanjose S, Quint W G, Alemany L, Geraets T cancer in China: the importance of HPV 16 and 18[J] Klaustermeier J E, Lloveras B, Tous S, Felix A, Bravo Cancer Causes Control, 2009. 20(9):1705-1713 L E, Shin H R, vallejos CS, de Ruiz P A, Lima M A, [12] Fakruddin M. Mannan K S. Chowdhury A, Mazumdar R M, Hossain M N, Islam S, Chowdhury M A. Nu- Cheng-Yang C, Tatti S A, Kasamatsu E, lljazovic E, cleic acid amplification: Alternative methods of poly- Odida M. Prado r, Seoud M. Grce M, Usubutun A merase chain reaction[J]. J Pharm Bioallied Sci, 2013 Jain A, Suarez G A, Lombardi L E, Banjo A 5(4):245-252 Menendez C, Domingo E J, Velasco J. Nessa A, Chich- [13] Burroni E, Sani C, Bisanzi S, Ocello C. HPV primary 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
的转归过程，其感染的 ＨＲ－ＨＰＶ 已经被机体清除， 由于 ＨＣ２发生交叉反应导致检测结果呈假阳性，故 其灵敏度为１００．００％。在本研究中，Ｉｓｏｍｅｇａ检 出 ＣＩＮ２＋的灵敏度为８７．７６％，与 ＨＣ２之间有统计学 差异（Ｐ＝０．０３１），除 去 两 例 ＨＣ２假阳性结果的标 本，Ｉｓｏｍｅｇａ 和 ＨＣ２ 的 灵 敏 度 分 别 为 ９１．４９％ 和 １００．００％，差异无统计学意义（Ｐ＝０．１２５）。 综上所述，ＩｓｏｍｅｇａＨＰＶ 检测技术是一种应用 于宫颈癌筛查的新技术，可以有效地检测 ＨＲ－ＨＰＶ ＤＮＡ，并对 高 致 癌 风 险 的 ＨＰＶ１６ 和 ＨＰＶ１８ 进 行 单独分型检测，提高了筛查针对性，可使临床医生更 好地指导和管理患者。Ｉｓｏｍｅｇａ具有较高的灵敏度 和特异度，适用于医院和大范围的宫颈癌筛查使用， 具有很好的应用前景。 参考文献： ［１］乔友林．中国妇女人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌的流行 病学研究现状及其疫苗预防前景［Ｊ］．中 华 流 行 病 学 杂 志，２００７，２８（１０）：９３７－９４０． ［２］ＭａｒｔｉｎＣ Ｍ，Ｏ＇ＬｅａｒｙＪＪ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉ－ ｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，２５（５）：６０５－６１５． ［３］ＶｉｄａｌＡ Ｃ，ＳｍｉｔｈＪＳ，ＶａｌｅａＦ，ＢｅｎｔｌｅｙＲ，Ｇｒａｄｉｓｏｎ Ｍ，ＹａｒｎａｌｌＫＳ，ＦｏｒｄＡ，ＯｖｅｒｃａｓｈＦ，ＧｒａｎｔＫ，Ｍｕｒ－ ｐｈｙＳＫ，ＨｏｙｏＣ．ＨＰＶｇｅｎｏｔｙｐｅｓａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉ－ ｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａｉｎａｍｕｌｔｉｅｔｈｎｉｃｃｏｈｏｒｔｉｎｔｈｅｓｏｕｔｈｅａｓｔ－ ｅｒｎ ＵＳＡ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣａｕｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２０１４，２５（８）： １０５５－１０６２． ［４］ＰｅｔｒｙＫ Ｕ，ＭｅｎｔｏｎＳ，Ｍｅｎｔｏｎ Ｍ，ｖａｎＬｏｅｎｅｎ－Ｆｒｏｓｃｈ Ｆ，ｄｅＣａｒｖａｌｈｏ Ｇｏｍｅｓ Ｈ，ＨｏｌｚＢ，Ｓｃｈｏｐｐ Ｂ，Ｇａｒ－ ｂｒｅｃｈｔ－ＢｕｅｔｔｎｅｒＳ，ＤａｖｉｅｓＰ，ＢｏｅｈｍｅｒＧ，ｖａｎｄｅｎＡｋ－ ｋｅｒＥ，ＩｆｔｎｅｒＴ．ＩｎｃｌｕｓｉｏｎｏｆＨＰＶｔｅｓｔｉｎｇｉｎｒｏｕｔｉｎｅｃｅｒ－ ｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｗｏｍｅｎａｂｏｖｅ２９ｙｅａｒｓｉｎＧｅｒ－ ｍａｎｙ：ｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒ８４６６ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，２００３， ８８（１０）：１５７０－１５７７． ［５］ＢｏｓｃｈＦＸ，ＬｏｒｉｎｃｚＡ，ＭｕｏｚＮ，ＭｅｉｊｅｒＣＪ，ＳｈａｈＫ Ｖ．Ｔｈｅｃａｕｓａｌｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ，２００２，５５（４）： ２４４－２６５． ［６］ｄｅＳａｎｊｏｓｅＳ，ＱｕｉｎｔＷ Ｇ，ＡｌｅｍａｎｙＬ，ＧｅｒａｅｔｓＤ Ｔ， ＫｌａｕｓｔｅｒｍｅｉｅｒＪＥ，ＬｌｏｖｅｒａｓＢ，ＴｏｕｓＳ，ＦｅｌｉｘＡ，Ｂｒａｖｏ ＬＥ，ＳｈｉｎＨＲ，ＶａｌｌｅｊｏｓＣＳ，ｄｅＲｕｉｚＰＡ，ＬｉｍａＭ Ａ， ＧｕｉｍｅｒａＮ，ＣｌａｖｅｒｏＯ，Ａｌｅｊｏ Ｍ，Ｌｌｏｍｂａｒｔ－Ｂｏｓｃｈ Ａ， Ｃｈｅｎｇ－ＹａｎｇＣ，ＴａｔｔｉＳ Ａ，ＫａｓａｍａｔｓｕＥ，ＩｌｊａｚｏｖｉｃＥ， ＯｄｉｄａＭ，ＰｒａｄｏＲ，Ｓｅｏｕｄ Ｍ，Ｇｒｃｅ Ｍ，ＵｓｕｂｕｔｕｎＡ， Ｊａｉｎ Ａ， Ｓｕａｒｅｚ Ｇ Ａ， Ｌｏｍｂａｒｄｉ Ｌ Ｅ， Ｂａｎｊｏ Ａ， ＭｅｎéｎｄｅｚＣ，ＤｏｍｉｎｇｏＥＪ，ＶｅｌａｓｃｏＪ，ＮｅｓｓａＡ，Ｃｈｉｃｈ－ ａｒｅｏｎＳＣ，ＱｉａｏＹＬ，ＬｅｒｍａＥ，ＧａｒｌａｎｄＳＭ，Ｓａｓａｇａｗａ Ｔ，Ｆｅｒｒｅｒａ Ａ，Ｈａｍｍｏｕｄａ Ｄ，ＭａｒｉａｎｉＬ，Ｐｅｌａｙｏ Ａ， ＳｔｅｉｎｅｒＩ，ＯｌｉｖａＥ，ＭｅｉｊｅｒＣＪ，Ａｌ－ＪａｓｓａｒＷ Ｆ，ＣｒｕｚＥ， ＷｒｉｇｈｔＴＣ，ＰｕｒａｓＡ，ＬｌａｖｅＣＬ，ＴｚａｒｄｉＭ，Ａｇｏｒａｓｔｏｓ Ｔ，Ｇａｒｃｉａ－Ｂａｒｒｉｏｌａ Ｖ，ＣｌａｖｅｌＣ，ＯｒｄｉＪ，Ａｎｄúｊａｒ Ｍ， ＣａｓｔｅｌｌｓａｇｕéＸ，ＳáｎｃｈｅｚＧＩ，ＮｏｗａｋｏｗｓｋｉＡ Ｍ，Ｂｏｒｎ－ ｓｔｅｉｎＪ，ＭｕｏｚＮ，ＢｏｓｃｈＦＸ，ＲｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ－ ａｌＳｕｒｖｅｙａｎｄＨＰＶ ＴｉｍｅＴｒｅｎｄｓＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ．Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｉｎｖａｓｉｖｅｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ：ａｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌｗｏｒｌｄｗｉｄｅｓｔｕｄｙ ［Ｊ］．ＬａｎｃｅｔＯｎｃｏｌ，２０１０，１１（１１）：１０４８－１０５６． ［７］ＲｉｊｋａａｒｔＤＣ，ＢｅｒｋｈｏｆＪ，ｖａｎＫｅｍｅｎａｄｅＦＪ，ＣｏｕｐｅＶ Ｍ，ＲｏｚｅｎｄａａｌＬ，ＨｅｉｄｅｍａｎＤＡ，ＶｅｒｈｅｉｊｅｎＲ Ｈ，Ｂｕｌｋ Ｓ，ＶｅｒｗｅｉｊＷ，ＳｎｉｊｄｅｒｓＰＪ，ＭｅｉｊｅｒＣＪ．ＨＰＶ ＤＮＡ ｔｅｓｔｉｎｇｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｃｅｒｖｉｃａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ （ＶＵＳＡ－ Ｓｃｒｅｅｎｓｔｕｄｙ）：ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃ－ ｅｒ，２０１２，１０６（５）：９７５－９８１． ［８］ＫｌｅｔｅｒＢ，ｖａｎＤｏｏｒｎＬＪ，ＳｃｈｒａｕｗｅｎＬ，ＭｏｌｉｊｎＡ，Ｓａｓ－ ｔｒｏｗｉｊｏｔｏＳ，ｔｅｒＳｃｈｅｇｇｅｔＪ，ＬｉｎｄｅｍａｎＪ，ｔｅｒＨａｒｍｓｅｌ Ｂ，ＢｕｒｇｅｒＭ，ＱｕｉｎｔＷ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｅｖａｌｕ－ ａｔｉｏｎｏｆａｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅＰＣＲ－ｒｅｖｅｒｓｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７ （８）．２５０８－２５１７． ［９］乔友林，李静．子宫颈癌筛查方法新进展［Ｊ］．医学研究 杂志，２００９，３８：３－４，１１０． ［１０］ＺｈａｏＦＨ，ＬｉｎＭＪ，ＣｈｅｎＦ，ＨｕＳＹ，ＺｈａｎｇＲ，Ｂｅ－ ｌｉｎｓｏｎＪＬ，ＳｅｌｌｏｒｓＪＷ，ＦｒａｎｃｅｓｃｈｉＳ，ＱｉａｏＹＬ，Ｃａｓ－ ｔｌｅＰＥ，ＣｅｒｖｉｃａｌＣａｎｃｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇＧｒｏｕｐｉｎＣｈｉｎａ．Ｐｅｒ－ ｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｈｉｇｈ－ｒｉｓｋｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＤＮＡｔｅｓ－ ｔｉｎｇａｓａｐｒｉｍａｒｙｓｃｒｅｅｎｆｏｒｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ：ａｐｏｏｌｅｄａ－ ｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐａｔｉｅｎｔｄａｔａｆｒｏｍ １７ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ ｂａｓｅｄｓｔｕｄｉｅｓｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．ＬａｎｃｅｔＯｎｃｏｌ，２０１０，１１ （１２）：１１６０－１１７１． ［１１］Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｍｏｌｉｊｎ Ａ，ＪｅｎｋｉｎｓＤ，ＳｈｉＪＦ， ＱｕｉｎｔＷ，ＳｃｈｍｉｄｔＪＥ，ＷａｎｇＰ，ＬｉｕＹＬ，ＬｉＬＫ，Ｓｈｉ Ｈ，ＬｉｕＪＨ，ＸｉｅＸ，ＮｉｙａｚｉＭ，ＹａｎｇＰ，ＷｅｉＬ Ｈ，Ｌｉ ＬＹ，ＬｉＪ，ＬｉｕＪＦ，ＺｈｏｕＱ，ＨｏｎｇＹ，ＬｉＬ，ＬｉＱ， ＺｈｏｕＨ Ｌ，ＢｉａｎＭ Ｌ，ＣｈｅｎＪ，ＱｉａｏＹＬ，ＳｍｉｔｈＪＳ． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒｉｎＣｈｉｎａ：ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆＨＰＶ１６ａｎｄ１８［Ｊ］． ＣａｎｃｅｒＣａｕｓｅｓＣｏｎｔｒｏｌ，２００９，２０（９）：１７０５－１７１３． ［１２］ＦａｋｒｕｄｄｉｎＭ，ＭａｎｎａｎＫＳ，ＣｈｏｗｄｈｕｒｙＡ，Ｍａｚｕｍｄａｒ Ｒ Ｍ，ＨｏｓｓａｉｎＭ Ｎ，ＩｓｌａｍＳ，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｍ Ａ．Ｎｕ－ ｃｌｅｉｃａｃｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｏｌｙ－ ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍＢｉｏａｌｌｉｅｄＳｃｉ，２０１３， ５（４）：２４５－２５２． ［１３］ＢｕｒｒｏｎｉＥ，ＳａｎｉＣ，ＢｉｓａｎｚｉＳ，ＯｃｅｌｌｏＣ．ＨＰＶｐｒｉｍａｒｙ ４期 王林，等．恒温扩增 ＨＰＶ 检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究 · ３０５ ·
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ｔｅｓｔｉｎｔｈｅｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｓ－ ｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｏｕｔｃｏｍｅｏｆ ＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ２ ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｐｒｅｖ，２０１６，４０（３－４）：１６４－１７０． ［１４］ＰｒｅｉｓｌｅｒＳ，ＲｅｂｏｌｊＭ，ＥｊｅｇｏｄＤ Ｍ，ＬｙｎｇｅＥ，Ｒｙｇａａｒｄ Ｃ，ＢｏｎｄｅＪ．Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ，ｃｏｂａｓ，ａｎｄＡＰＴＩＭＡｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓａｓｓａｙｓ： ｓｐｌｉｔ－ｓａｍｐｌｅｓｔｕｄｙ［Ｊ］．ＢＭＣＣａｎｃｅｒ，２０１６，１６：５１０． ［１５］ＣａｓｔｌｅＰＥ，Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ Ｍ，ＢｕｒｋＲ Ｄ，ＷａｃｈｏｌｄｅｒＳ， Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，ＨｅｒｒｅｒｏＲ，ＢｒａｔｔｉＭＣ，ＳｈｅｒｍａｎＭＥ， ＬｏｒｉｎｃｚＡ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｙｂｒｉｄｃａｐｔｕｒｅ ２ｗｉｔｈｎｏｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅｓ［Ｊ］． ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ，２００２，１１（１１）： １３９４－１３９９． ［１６］ＦｏｒｎａｒｉＤ，ＲｅｂｏｌｊＭ，ＢｊｅｒｒｅｇｒｄＢ，ＬｉｄａｎｇＭ，Ｃｈｒｉｓ－ ｔｅｎｓｅｎＩ，ＨｇｄａｌｌＥ，ＢｏｎｄｅＪ．ＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ２ａｎｄ ｃｏｂａｓｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓａｓｓａｙｓｐｅｒｆｏｒｍ ｓｉｍｉｌａｒｌｙ ｏｎＳｕｒｅＰａｔｈｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１６，２７（４）：２４９－２６０． ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＨＰＶＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎ ＣｅｒｖｉｃａｌＣａｎｃｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇ ＷＡＮＧＬｉｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎｇｙｕｅ２，ＣＡＯＸｕｅｆａｎｇ２，ＬＩＬｉ３，ＱＩＮ Ｙｕ２， ＷＵＺｅｎｉ２，ＬＩＴｉｎｇｙｕａｎ２，ＷＵ Ｔｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｗｅｎ２＊ （１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＶａｃｃｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ，ＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ３６１１０２，Ｃｈｉｎａ； ２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ／ＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ ｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｎａ； ３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ，ＸｉｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｃｈｉ８３００１１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｕｔｉｌｉｔｙｏｆｉｓｏｔｈｅｒｍａｌＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｓｔ（Ｉｓｏｍｅｇａ）ｉｎｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＲ－ＨＰＶ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＦｒｏｍＪｕｎｅｔｏＡｕｇｕｓｔｉｎ２０１６， ２，７７４ｗｏｍｅｎａｇｅｄｆｒｏｍ３０ｔｏ６４ｙｅａｒｓｏｌｄｗｉｔｈｓｅｘｕａｌａｃｔｉｖｉｔｙｈｉｓｔｏｒｙｗｅｒｅｒｅｃｒｕｉｔｅｄｉｎＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａｆｏｒｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｌｉｑｕｉｄ－ｂａｓｅｄｃｙｔｏｌｏｇｙ，ＩｓｏｍｅｇａａｎｄＨｙｂｒｉｄＣａｐｔｕｒｅ２（ＨＣ２）ｔｅｃｈｎｏｌ－ ｏｇｉｅｓｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒａｌｌｓａｍｐｌｅｓ．ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ＨＰＶＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＥｘｔｒａｗａｓｕｓｅｄａｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏｅｖａｌｕａｔｅ ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｂｙｔｈｅｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｅｉｔｈｅｒＨＰＶ１６ｏｒＨＰＶ１８ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉ－ ｆｉｃｉｔｙｏｆＩｓｏｍｅｇａａｎｄＨＣ２ｗｅｒｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａｇｒａｄｅ２ （ＣＩＮ２）ａｎｄＣＩＮ２＋ ｗｅｒｅａｌｓｏｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＴｈｅｔｏｔａｌｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｒａｔｅｆｏｒＩｓｏｍｅｇａａｎｄ ＨＣ２ｗａｓ９２．７２％ （Ｋａｐｐａ＝０．７４），ｉｎ ｗｈｉｃｈｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｒａｔｅｗａｓ８６．７８％，ａｎｄｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９３．７７％．Ｏｎｔｈｅ ｂａｓｉｓｏｆＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｒａｔｅｏｆ ＨＰＶ１６ａｎｄ ＨＰＶ１８ ｗａｓ９４．７４％ ａｎｄ ８３．８７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｆｏｒＩｓｏｍｅｇａ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｗｅｒｅ８７．７６％ａｎｄ８２．９４％ｆｏｒＩｓｏｍｅｇａ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｄａｔａｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔＩｓｏｍｅｇａＨＰＶｔｅｓｔｃａｎｄｅｔｅｃｔＨＰＶ１６ａｎｄＨＰＶ１８ａｎｄｏｔｈｅｒｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ＨＰＶａｃｃｕｒａｔｅｌｙ，ａｎｄｙｉｅｌｄｆａｉｒｌｙｇｏｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｆｏｒｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ；Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）；Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮ Ｗｅｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｗｅｎ＠ｃｉｃａｍｓ．ａｃ．ｃｎ · ４０５ · 病 毒 学 报 ３４卷
