《珠江水产》总19期 t892。10 作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988年首先完成了草鱼出血病高滴度强毒株弱 毒化驯化,制备了草鱼出血病细胞弱毒疫苗〔湿苗和冻干苗),进行了小型实验、中间 产表证,获得良好效果。本文报告这一工作。 村料与方法 毒种驯化 1、病毒提取 从珠江三角洲地区池塘采集具有典型草鱼出血病症状的病鱼,取其肝丶脾、肾组 织,称重、剪碎后,用玻璃研磨器匀浆然后加入不含血清的199培养液使成10-浓度, 置冰箱预冷至4℃,经10000°m离心20分钟,吸取上清液,加入1000单位/毫升青霉素 和100微克/毫升链霉素,放4℃冰箱过液,即为除菌组织病毒液。 2、毒株筛选 用采自珠江三角洲不同地区的野毒材料,分别制备除菌组织病毒液。通过鱼体感染 扩大或接种PSF细胞增殖,回归感染草鱼,从中篼选出毒力强的毒株,作为弱毒驯化的 种毒 8丶种毒弱毒化驯化 取长成致密单层的PSF细胞,用0,25%胰蛋白酶和0,02%乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)消液消化一分钟左右,加入含10%小牛血清pH72左右的199培养液,吹打 分散细胞,然后以1:100的比例加入种毒,一分为四分装细胞瓶内(细胞浓度约1·5 104个/毫升)。在一定条件下静止培养,7~10天收获。-20℃冰结。冻融后收获细胞 病毒液,即为某一代的种毒。按上述方法在PSF细胞中连续继代驯化。与此同时,每代 种毒以10°~10-浓度03毫升/尾剂量注射接种全长9~12厘米的草鱼,作毒力检查。接 种15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,检查其免疫保护力 、细胞弱毒疫苗制备 1、细胞培养弱毒湿苗 采用静止和旋转两种培养方法制备 静止培养方法同“种毒弱毒化驯化”的继代培养。用10°浓度03毫升/尾剂量感染 全长9~12厘米草鱼,安全、免疫原性强的84~1号弱毒株缩选代作毒种 旋转培养用每小时15转的转鼓带动大容量的小口旋转培养瓶。接种毒种代数及其浓 度、接种方法、培养液成份、培养条件及时间同静止培养。但接种的细胞浓度比静止培 养大一培。《珠 江水 产 》 总19期 l明2．10． ＼ ．作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988~首先完成了草龟出血病高滴度强l篓毋 r ，‘■■■ 毒化驯 化，制备 了草鱼 出血病 细胞 弱毒疫苗 (湿 苗和冻千苗 )，进行 了小型 实验 、中间 等 。 一 、 毒 种 驯 化 1、病 毒提取 从珠江三 角洲地 区池塘采集具有典 型草鱼 出血病症状 的 病 鱼 ，取其肝 、脾 、肾组 织。称重 、剪 碎后 ，用 玻璃 研磨器匀浆 ，然后加入不含血清 的199培养液使成 10I1浓度 ， 置冰 箱预 冷至 4℃，经 10000rpm离心20分钟 ，吸取上 清液 ，加．x．1000单位／毫升青 霉 素 和 1000微克／毫升链霉素 ，放 4℃冰箱过液， 即为 除菌 组织 病毒 液。 2 、毒株 筛选 用采 自珠 江三 角洲不 同地 区的野 毒材料，分 别制备除 菌组 织病毒液。通过鱼体 感染 扩大或接 种PSF细胞增 殖，回归感染 草鱼， 从中筛选 出毒力强 的毒株， 作为弱毒驯化 的 种毒 。 3、种毒 弱毒化驯化 取长成致密单 层 的PSF细胞 ，用0．25％胰蛋 白酶 和0．02％ 乙 二 胺 四 乙 酸 二 铺 (EDTA )消液消化一分钟左 右，加入含 10％小 牛血 清、pH7．2左右 的199培养 液 ，吹打 分 散细胞 ，然 后 以 1t100的比例加入种 毒，一分 为 四分装 细胞瓶 内 (细胞 浓度 约 1．5× lO个／毫升 )。在 一定 条件下静止培 养， 7～ l0天收获。 一20℃冰 结。冻融后 收获 细胞 病 毒液，即为某一代 的种毒 。按 上述方 法在PSF细胞 中连 续继代驯化。 与此 同时，每代 种毒以10。～l0 浓度0．3毫升／尾剂量注射接种全长 9～l2厘米的草鱼，作毒力检查。接 种 l5天后 以100LD5o的强毒 0．2毫升／尾的剂量攻击 ，观 察15~2o天 ，检查 其免疫保护力。 二、 细胞 弱毒 疫 苗 制备 l、细 胞培养 弱毒湿苗 采用静止和旋转两 种培养方法制备 。 静止培养方法同 种毒弱毒化驯化”的继代培养 。用l0。浓度o．3毫升／尾剂量感染 全 长 9～l2厘米草鱼 ，安全 、免 疫原性强 的84～ l号弱毒株筛 选代 作 毒种。 旋转 培养用 每小时 l5转的转 鼓带动大 容量的小 71旋转培养瓶 。接种毒种代数 及其 浓 度、接种方 法、培养液成份、培 养条件及时 间同静止培养。但 接种的细胞浓度 比静止 培 养大 一培。 24 维普资讯 http://www.cqvip.com