标准样品当OD260=1时,RNA浓度约为40μgm1,根据下述公式计算RNA 浓度:RNA浓度(μg/ml)=OD26×稀释倍数×40 (2)电泳检测:1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量,电泳槽及制胶板先 用3%过氧化氢浸泡过夜;制1%甲醛变性凝胶板:4.5μRNA,2ul5×甲醛胶 电泳缓冲液,3.5μ37%甲醛,10ul甲酰胺,离心混匀,65℃变性15min后, 迅速置冰浴中;再加入2山RNA上样缓冲液,离心混匀后上样,6V/cm电压, 电泳1~2h:暗室内紫外光下观察,拍照;如果观察到清晰的18S、28SRNA 电泳带,无大量小分子RNA,说明RNA无明显降解,样品一70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h以上,非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后,经高温(15磅,20min)处理灭活RNA酶,所用试剂均用 DEPC水配制,然后高压处理。 2、实验用水要经DEPC处理,但含Tris的试剂不能用DEPC处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套,以避免RNA酶污染。 第三节质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb~200kb的DNA,存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一,获得大量纯化的质粒 DNA是基因克隆的前提条件。 、碱裂解法提取质粒DNA的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为: 共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH12~125时线性 DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂,经酸中和后,共价闭 合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性,只能聚合成网 状结构,离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA 可用乙醇沉淀出来。5 标准样品当 OD260＝1 时，RNA 浓度约为 40μg/ml，根据下述公式计算 RNA 浓度：RNA 浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。 （2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察 RNA 质量，电泳槽及制胶板先 用 3%过氧化氢浸泡过夜；制 1%甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛胶 电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul 甲酰胺，离心混匀，65℃变性 15min 后， 迅速置冰浴中；再加入 2μl RNA 上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm 电压， 电泳 1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的 18S、28S RNA 电泳带，无大量小分子 RNA，说明 RNA 无明显降解，样品－70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿 160～180℃高温干烤 6h 以上，非耐高温器皿经 0.1% DEPC 液浸泡后，经高温（15 磅，20min）处理灭活 RNA 酶，所用试剂均用 DEPC 水配制，然后高压处理。 2、实验用水要经 DEPC 处理，但含 Tris 的试剂不能用 DEPC 处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免 RNA 酶污染。 第三节 质粒 DNA 的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约 1kb200kb 的 DNA，存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒 DNA 是基因克隆的前提条件。 一、碱裂解法提取质粒 DNA 的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为： 共价闭合环状 DNA 与线性 DNA 的拓扑学性质不同。在 PH1212.5 时,线性 DNA 会完全变性,而共价闭合环状 DNA 只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭 合环状 DNA 可迅速准确的复性。而线性 DNA 不能准确复性，只能聚合成网 状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA 一起沉淀下来。上清液中的质粒 DNA 可用乙醇沉淀出来